一、问题:RT-PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 可能原因: 1.RNA被降解 建议解决方法: 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA; 在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA; 如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。 2.RNA中包含逆转录抑制剂 建议解决方法: 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。 逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐。 将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。 3.多糖同RNA共沉淀 建议解决方法: 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 4.用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 建议解决方法: 确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。 对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体. 确定GSP是反义序列。 5.起始RNA量不够 建议解决方法: 增加RNA量。 对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 6.RNA模板二级结构太多 建议解决方法: 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火. 提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。 注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。 注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。 7.引物或模板对残余的RNA模板敏感 建议解决方法: 在PCR前用RNaseH处理。 8.靶序列在分析的组织中不表达 建议解决方法: 尝试其他靶序列或组织 9.PCR没有起作用 建议解决方法: 对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。 二、问题:PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 可能原因: 1.PCR引物设计较差 建议解决方法: 避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 2.DNA含有抑制剂 建议解决方法: 诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA。 3.富含GC的模板 建议解决方法: 对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。 4.模板浓度太低 建议解决方法: 使用104拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。 5.镁离子浓度太低 建议解决方法: 从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。 6.退火温度太高 建议解决方法: 使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。 7.引物浓度太低 建议解决方法: 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。 (责任编辑:泉水) |