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PCR/RT-PCR疑难问题解答

时间:2003-11-21 00:00来源:本站原创 作者:admin 点击: 1671次

一、问题:RT-PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。

可能原因:

1RNA被降解

建议解决方法:

在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA

在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA

如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT

2RNA中包含逆转录抑制剂

建议解决方法:

通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。

逆转录抑制剂包括:SDSEDTA,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐。

将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。

3.多糖同RNA共沉淀

建议解决方法:

使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。

4.用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火

建议解决方法:

确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。

对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体.

确定GSP是反义序列。

5.起始RNA量不够

建议解决方法:

增加RNA量。

对于<50ngRNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg0.5μg乙酰BSA

6RNA模板二级结构太多

建议解决方法:

RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.

提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃

注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于>1kbRT-PCR产物,保持反应温度≤65℃

注意:不要在高于37℃时使用M-MLV

如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。

7.引物或模板对残余的RNA模板敏感

建议解决方法:

PCR前用RNaseH处理。

8.靶序列在分析的组织中不表达

建议解决方法:

尝试其他靶序列或组织

9PCR没有起作用

建议解决方法:

对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。

二、问题:PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。

可能原因:

1PCR引物设计较差

建议解决方法:

避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。

2DNA含有抑制剂

建议解决方法:

诸如DMSOSDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA

3.富含GC的模板

建议解决方法:

对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution

4.模板浓度太低

建议解决方法:

使用104拷贝的靶序列,以在2530个循环中获得信号。

5.镁离子浓度太低

建议解决方法:

1mM3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM5mM的镁离子浓度。

6.退火温度太高

建议解决方法:

使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。

7.引物浓度太低

建议解决方法:

最佳引物浓度介于0.1μM0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。

(责任编辑:泉水)
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