探针的标记和标记产物的纯化 这里介绍三种标记方法:PCR标记、反转录标记、随机引物标记,和两种纯化方法:Microcon 30 filter法和直接沉淀法。 一、PCR标记 1、将2μg待标记的样品DNA加入到一PCR反应管中 2、在冰上,加:
3、混匀上述试剂后,将PCR反应管置于PCR仪中,按下列程序进行PCR反应:
4、取出PCR反应管,-20℃避光保存待杂交。 二、反转录标记 1、将待标记的样品 mRNA (约2-3μg)加到Rnase-free 1.5ml 离心管中,加适量双蒸水,使体积为60μl 2、向离心管中加入3μl 10μm的Oligo dT18 3、混匀上述试剂后,于72℃变性5分钟 4、变性后的离心管立即置于冰上冷却,再加入下列试剂:
5、混匀上述试剂后,于37℃保温5分钟或26℃保温10分钟 6、42℃保温1小时 7、补加反转录酶0.75μl,然后继续于42℃保温0.5小时 8、取出PCR反应管,-20℃避光保存待杂交 9、用双蒸水调整探针混合物,使体积为12μl,然后加入2.55μl 20×SSC( 使终浓度为3.4×)和0.45μl 10%SDS(使终浓度为 0.3%) 10、将杂交混合物先于95℃变性1.5分钟,再于37℃温浴30小时(Cot-1预退火),然后和微矩阵杂交。 三、随机引物标记 比较基因组杂交中基因组DNA可用Gibco/BRL的BioPrime DNA标记试剂盒中简单的随机引物标记 1、将2μg待标记的样品DNA加入一离心管中 2、加适量双蒸水或TE(pH8.0),使总体积为21μl,再加20μl 2.5×随机引物和反应缓冲液的混合物。煮沸5分钟后 置于冰上 3、上,加5μl 10×dNTP混合物 10×dNTP混合物: 1.2mM dATP - dGTP - dTTP 0.6mM dCTP 10 mM Tris (pH8.0),1 mM EDTA 4、加3μlCY5-dCTP或CY3-dCTP(Amersham, 浓度为1 mM); 5、加1μl大肠杆菌DNA聚合酶I大片段; 6、37℃温浴1-2小时,然后加5μl 0.5M EDTA (pH8.0)来终止反应。 四、Microcon 30 filter纯化(Amicon/Millipore) 1、向已终止的标记体系中加入450μl(pH7.4)TE 2、放在microcon 30 filter中,以8000g旋涡10分钟(或在微量离心机中以10,000rpm 离心) 3、以8000g 旋转1分钟,回收纯化的探针于一新管(约20-40μl)。 五、直接沉淀法 1、加入6μl 10μg/μl tRNA 6μl 3 mM NaAC 150μl 100%乙醇,-20℃ ,30分钟,13000 rpm离心, 2、75%乙醇洗涤3次,干燥备用。 (责任编辑:泉水) |