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探针的标记和标记产物的纯化

时间:2003-11-24 00:00来源:本站原创 作者:admin 点击: 787次

探针的标记和标记产物的纯化


这里介绍三种标记方法:PCR标记、反转录标记、随机引物标记,和两种纯化方法:Microcon 30 filter法和直接沉淀法。

一、PCR标记

1、将2μg待标记的样品DNA加入到一PCR反应管中

2、在冰上,加:

  反应缓冲液 5μl
  25 mM MgCl2 4μl
  10 mM dATP - dGTP - dTTP 1μl
  1 mM dTTP 1μl
  10 μM 引物混合物 1μl
  双蒸水 36.5μl
  0.1 mM CY5-dUTP 1μl
  Taq DNA 聚合酶 0.5μl

3、混匀上述试剂后,将PCR反应管置于PCR仪中,按下列程序进行PCR反应:

  ① 95℃ 1.5min
  ② 95℃ 0.5min
  ③ 55℃ 0.5min
  ④ 72℃ 0.5min
  ⑤ goto ① for 39 cycles
  ⑥ 72℃ 5min
  ⑦ 4℃ forever
    END

4、取出PCR反应管,-20℃避光保存待杂交。

二、反转录标记

1、将待标记的样品 mRNA (约2-3μg)加到Rnase-free 1.5ml 离心管中,加适量双蒸水,使体积为60μl

2、向离心管中加入3μl 10μm的Oligo dT18

3、混匀上述试剂后,于72℃变性5分钟

4、变性后的离心管立即置于冰上冷却,再加入下列试剂:

  5×First Strand Buffer 20μl
  0.1M DTT 10μl
  10 mM dATP - dGTP - dTTP 2μl
  1 mM dTTP 2μl
  SUPERSCRIPT II 反转录酶 1.5μl
  1 mM CY-dUTP 2μl

5、混匀上述试剂后,于37℃保温5分钟或26℃保温10分钟

6、42℃保温1小时

7、补加反转录酶0.75μl,然后继续于42℃保温0.5小时

8、取出PCR反应管,-20℃避光保存待杂交

9、用双蒸水调整探针混合物,使体积为12μl,然后加入2.55μl 20×SSC( 使终浓度为3.4×)和0.45μl 10%SDS(使终浓度为 0.3%)

10、将杂交混合物先于95℃变性1.5分钟,再于37℃温浴30小时(Cot-1预退火),然后和微矩阵杂交。 

三、随机引物标记

比较基因组杂交中基因组DNA可用Gibco/BRL的BioPrime DNA标记试剂盒中简单的随机引物标记

1、将2μg待标记的样品DNA加入一离心管中

2、加适量双蒸水或TE(pH8.0),使总体积为21μl,再加20μl 2.5×随机引物和反应缓冲液的混合物。煮沸5分钟后 置于冰上

3、上,加5μl 10×dNTP混合物

        10×dNTP混合物:

          1.2mM dATP - dGTP - dTTP

          0.6mM dCTP

          10 mM Tris (pH8.0),1 mM EDTA

4、加3μlCY5-dCTP或CY3-dCTP(Amersham, 浓度为1 mM);

5、加1μl大肠杆菌DNA聚合酶I大片段;

6、37℃温浴1-2小时,然后加5μl 0.5M EDTA (pH8.0)来终止反应。

四、Microcon 30 filter纯化(Amicon/Millipore)

1、向已终止的标记体系中加入450μl(pH7.4)TE

2、放在microcon 30 filter中,以8000g旋涡10分钟(或在微量离心机中以10,000rpm 离心)

3、以8000g 旋转1分钟,回收纯化的探针于一新管(约20-40μl)。

五、直接沉淀法

1、加入6μl 10μg/μl tRNA

     6μl 3 mM NaAC

     150μl 100%乙醇,-20℃ ,30分钟,13000 rpm离心,

2、75%乙醇洗涤3次,干燥备用。

 

(责任编辑:泉水)
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