DNA重组技术-感受态细胞的制备
制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞
　　下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制备的大肠杆菌DHl、DH5和ＭＭ249感受态细胞培养物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108转化菌落的频率进行转化，其他大多数大肠杆菌菌株的最高转化率大约只有前述菌株的1/10-1/5。尽管如此，实际上对所有克隆方面的用途来说，这已绰绰有余。一些大肠杆菌菌株（如ＭＣ1061）不适于此法。下列有３个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的：
（１）转化缓冲液中试剂的纯度务必使用所能得到的最高质量的试剂，这些试剂应分装成小份，避光保存于冷处。
（２）细胞的生长状态由于一些不清楚的原因，直接用贮存于-70┴冰冻培养基中的贮存原种接种而进持培养的细菌，所得到的转化效率最高，不应使用在实验室中连续传代，贮存于４℃或贮存于室温的培养物。（３）玻璃和塑料器皿的清洁度痕量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大地降低细菌的生长效率，所以最好拨出一批玻璃器皿专用于制备感受态细菌，而不作它用。这些玻璃器皿应用手洗刷，再灌满纯水（Ｍilli-Ｑ级或与其相当的级别），然后高压灭菌，临用前方把水倒掉。细心操作的话，几乎总是可以获得转化效率高的感受态细胞，每微克超螺旋ＤＮＡ可能得到5x107-1x108个转化菌落。然而甚至经验最为丰富的工作者也不可能保证，有必要用标准的螺旋质粒ＤＮＡ制品来检测每一批新的感受态细胞的转化效率。制备感受态细胞前，先制备一大批的螺旋质粒ＤＮＡ，分装成许多小份贮存于-70℃。这些标准制品可用来检验每一批新的感受态细胞的转化效率，并检查每一个实验的转化效率。设立这样一个阳性对照后，如果某一次实验得不到转化菌落，就可以根据对照的情况查明宣究竟是感受态细菌方面有庇漏，还是ＤＮＡ制品间有差异。分装的感受态细菌可在-70℃保存几个月而转效率无明显下降。
１）用无菌铂丝直接蘸取冻存有大肠杆菌ＤＨl株（或ＤＨ５株、ＭＭ249株原种）（贮存于-70℃的冻培养基上，见附录Ａ），在SOB琼脂平板表面划线，于37℃培养16小时。将冰冻的细菌融化，铂丝在冻存细菌原种的表面划过时，已带上足量的细菌，因此一管冻存细菌原种可使用多次。
２）将４－５个分隔良好的菌落转移到１ml含20mmol/L MgSo４的SOB中，菌落直径为１－２mm。中速振荡使细菌分散，然后在1L锥瓶中用30-100ml含20mmol/LMgSO4的SOB稀释培养物。
３）于37℃将细菌培养0.5-3.0小时，为达到高效转化，活细胞数务必少于108细胞/ml，可每隔20-30分钟测定ＯＤ600值来检测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长培养物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各稀释度的培养物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。
４）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作。
５）于４℃用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
６）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
７）用约20ml（每个50ml管）用冰预冷的转化缓冲液（对于TFB,见表1.3；对于FSB，可参见表1，4）轻轻振荡，重悬沉淀（若制备需立即使用的感受态细胞可用TFB:若制备需要贮存于－70℃的感受态细胞则用FSB），将重悬细胞冰浴10分钟。
８）于４℃用Sorvall GS3转头或与其相当的转头）以4000转．分离心10分钟，回收细胞。
９）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
10）用４ml（每个50ml管）用冰预冷的ＴＦＢ或ＦＳＢ轻轻振荡重悬沉淀。按步骤11）a给出的操作程序制备立即使用的感受态细胞，而步骤11）b制德贮存于-70℃留待以后使用的感受态细胞。
11）a.新鲜感受态细胞的制备a）将140μl DnD溶液加到每一悬液的中心，立即轻轻旋转以混匀悬液，然后在冰上放置15分钟。 DnD溶液 二硫苏糖醇（DTT) 1.53g DMSO 9.0ML 1mol/L乙酸钾（pH78.5) 100μl 水至 10MLDnD溶液作可耐受人机溶剂的Millex SR膜（Millipore）过滤除菌，将DnD溶液分装成160μl小份放入0.5ml的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于-20℃。DMSO的氧化产物，据推测可能是二甲硫醚，是转化的掏物。为避免这个问题，应购买质量最好的DMSO。应将所购试剂分装成10ml小份，放入无菌试管，密封管口，贮存于-70℃。每小份只用１次，用后弃去。１mol/L乙酸钾（pH7.5）的配法。b）每管再加140μlDnD溶液，轻轻旋转混匀之，将悬液置于冰上，再放15分钟。c）将小份悬液分装到冷却的无菌聚丙烯管（Falcon 2059,17x100mm）中，将管置于冰上。就大多数克隆方面的用途来说，50μl感受细胞悬液已绰绰有余。然而，如需要更大量的转化菌落（如构建cDNA文库），每小份感受态细胞的量可能需要加大些．加入ＤＮＡ后[步骤12)]，于42℃短暂加热感受态细胞[步骤13)]，这是一个关键步骤，务必以正确的升温速度使细胞加温到正确的温度。下面给出的所有时间和温度是用Falcon 2059型管获得的数据，其他类型的管未必可产生相同的结果。b.冻存的感受态细胞的制备 a）每４ml重悬细胞加140 μl DMSO，轻轻旋转混匀之，将悬液置冰上15分钟。b）每份悬液再加140μl DMSO，轻轻旋转混匀之，重新放入冰浴中。c）迅速将悬液分装到冷却的无菌的微时离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。贮存于-70℃备用。就大多数克隆方面的用途来说，50μl感受态细胞悬液已绰绰有余。然而，如需要更大量的转化菌落（如构建cDNA文库），每小份感受态细胞的量可能需要加大些。d）需要时，从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手民主，融化细胞。细胞一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置10分钟。e）用一冷却的无菌吸头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管中（Falcon2059,17x100mm）中，放置在冰浴上。加入ＤＮＡ后[步骤12)]，于42℃短暂加热感受态细胞[步骤３)]，这是一个关链步骤，务必以正确的升温速度使细胞如温到正确的温度。下面给出的所有时间和温度是用Falcon 2059试管获者的数据，其他类型的管未必可产生相同的结果。
12）将ＤＮＡ加入到感受态细胞中，轻轻旋转几认混匀内容物。在冰上放置30分钟。为得到最佳结果，ＤＮＡ溶液的体积不应超过感受态细胞体积的５％。转化体的数量相对于所加入的ＤＮＡ量近妣例地增加，直至系统达到饱和，尽管感受态细胞在不同批次之间有一些差异，50μl感受态细胞通常可被约lng超粒ＤＮＡ所饱和。虽然再加ＤＮＡ也不影响转化体的总产量，但使用过多的ＤＮＡ将降低系统的效率（以每微克ＤＮＡ所获转化体的数量来衡量）。当所转化的ＤＮＡ很难得时（如用从相对难得的样品中提取mRNA而合成的cDNA），这就显得格外重要。为最大限度地提高转化菌落的数目，可把现有ＤＮＡ分置于几小份感受态细胞中，以期系统不致饱和。试验中一定包括下面的对照：a.加入已知量的标准超螺旋质粒ＤＮＡ制品的感受态细胞。b.完全不加质粒ＤＮＡ的感受态细菌。
13）将管放入预加温到42℃的循环水浴中放好的试管加架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。
14）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却１－２分钟。
15）每管加800μl ＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育43分钏使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。为最大限度地提高转化效率，复苏期中应温放地摇动细胞（转速225转/分）。
16）将适当体积（每个90m平板达200μl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和相应抗生素的ＳＯＢ琼脂培养基上。如培养物体积太小（〈10μl），可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平表面。如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞（于室温用Sorvall SS34转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟），然后用适量SOC轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或铺在软琼脂中）。然而如选用氨苄青霉素抗性，则只能将一部分培养物（根据实验决定）铺在单独的平皿上，氨苄青霉素抗性菌落数的曾加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长抑制物质的缘故。\par 17）将平板置于室温直至液体被吸收。
18）倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺平板时密度应较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37℃培养平板时不应超过20小时。氨苄青霉素抗性的转化体可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时菌浓度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉敏感的卫星菌落。在培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60μg/ml增至100μg/ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。
用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞
　　下面的简单方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。
１）从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各黧度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。
２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作。
３）于４℃用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。
４）倒出培养液，将管倒置１分钏以使最后残留的痕量培养液流尽。
５）以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。我们发现将１mol/L CaCl2贮存液[用纯水（Ｍille-Q级或与其相当的级别）配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100mlk，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。对于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在这一步采用TFB（见表1.3）代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。
６）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。
７）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
８）每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2[或ＴＦＢ，见表1.3和步骤５）注]重悬每份细胞沉淀。此时，可将细胞分成小份，放于-70℃冻存[有关讨论请参见53页本节（二）步骤11)b.c)]。在这些条件下，尽管长期保存后转化效率会稍有下降，但细胞仍可保持处于感受态。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明细胞可以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小时，在贮存的最初12-24小时内，转化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。
９）用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加ＤＮＡ（体积∞10μl,ＤＮＡ∞50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
10）将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。
11）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却１－２分钟。
12）每管加800μlＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水溶将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。如果要求更高的转化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞（转速不超过225转/分）。
13）将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和相应抗生素的ＳＯＢ琼脂培养基上。如培养物体积太小（〈10μl）。可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞，然后用适量ＳＯＣ轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或铺在软琼脂中）。然而如选用氨苄青霉素抗性，则只能将一部分培养物（根据实验决定）铺在单独的平皿上。氨苄青霉素抗性功的增加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长掏物质的缘故。
14）将平板置于室温直至液体被吸收。
15）倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺增板时密度较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37℃培养平板时不应超过20小时。氨苄青霉素抗性的转化可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时密度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60μg/ml增至100μg/ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。