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高效毛细管电泳法

时间:2004-02-07 00:00来源:本站原创 作者:admin 阅读:
高效毛细管电泳法(High Perfor-mance Capillary Electrophoresis, HPCE),是以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为推动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。和传统的电泳技术和现代色谱技术比较,HPCE的突出特点是:

(1) 仪器简单、操作简便。

(2) 分析速度快,分离效率高。

(3) 操作模式多,开发分析方法容易。

(4) 实验成本低、消耗少。 (5) 应用范围极广。


一 电泳的发展进程


电泳(Capillary Electrophoresis,CE)是电介质中带电粒子在电场作用下以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象,利用这种现象对化学组分进行分离分析的技术称为电泳技术。电泳作为一种技术出现,已有近百年的历史,但真正被视为一种在生物化学中有重要意义的技术,是由1937年A.Tiselius首先提出,他利用电泳技术第一次从人的血清中分离出白蛋白、a球蛋白、b球蛋白和g球蛋白。A.Tiselius对电泳技术的贡献,使他获得了1948年诺贝尔奖。

传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热,1967年 Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis,CZE)。但他没有完全克服传统电泳的弊端。现在所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出,他们使用了75mm的毛细管柱,用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳,开创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC)。1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年,Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来,将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中,又发展了电色谱,扩大了电泳的应用范围。

从以上可以看出,毛细管电泳发展迅速,是色谱最活跃的领域之一。


二 电泳的基本原理


毛细管电泳所用的石英毛细管柱,在pH>3的情况下,其内表面带负电,和缓冲液接触时形成双电层,在高压电场的作用下,形成双电层一侧的缓冲液由于带正电荷而向负极方向移动形成电渗流。同时,在缓冲液中,带电粒子在电场的作用下,以不同的速度向其所带电荷极性相反方向移动,形成电泳,电泳流速度即电泳淌度。带电粒子在毛细管缓冲液中的迁移速度等于电泳淌度和电渗流的矢量和。各种粒子由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不同等因素引起迁移速度不同而实现分离。


三 毛细管电泳的分离模式


1. 毛细管区带电泳。

2. 毛细管凝胶电泳,分凝胶和无胶筛分两类。

3. 胶束电动毛细管色谱,在缓冲液中加入离子型表面活性剂,形成胶束,被分离物质在水相和胶束相之间分配并随电渗流在毛细管内迁移,达到分离。

4. 亲和毛细管电泳,在毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基,以亲和力的不同达到分离。

5. 毛细管电色谱,是将高效液相色谱(HPLC)的固定相填充到毛细管中,或在毛细管内壁涂布固定相,以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。此模式兼具电泳和液相色谱的模式。 6. 毛细管等电聚焦电泳。通过内壁涂层使电渗流减到最小,在两个电极槽分别装酸和碱,加高电压后,在毛细管内壁建立pH梯度,溶质在毛细管中迁移至各自的等电点,形成明显区带。聚焦后,用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值使溶质通过检测器

7. 毛细管等速电泳,采用先导电解质和后继电解质,使溶质按其电泳淌度不同得以分离

以上各模式以1、2、3种应用较多。


四 毛细管电泳应用主要的检测器


见表。


五 对仪器的要求及操作影响因素


毛细管电泳法所用仪器为毛细管电泳仪。采用毛细管电泳法测定的品种,其项下规定的测定参数,除规定的分析模式、检测方法(如紫外或荧光检测器的波长,电化学检测器的印加电位等)应按规定操作条件外,其它参数如毛细管内径、长度,缓冲液的pH、浓度,改性剂(甲醇、乙腈等有机溶剂),运行电压的大小,运行时间的长短,毛细管的温度等,均可参照品种项下的规定,根据所用仪器的条件和预实验的结果,进行必要的调整。


六 操作要点


1. 将毛细管电泳仪放置于有空调的房间,保持室温恒定。同时,操作中控制毛细管及仪器恒温。

2. 缓冲液加压一段时间后,淌度和电渗流会变化,要经常更换。

3. 缓冲液要用0.45mm微孔滤膜过滤后使用。

4. 对未涂渍的毛细管柱每天使用前先用0.1mol/L氢氧化钠溶液、水及运行缓冲液各冲洗10min平衡后使用。更换缓冲液时,要用水冲洗3min后,再用缓冲液冲洗10min平衡后进样。

5. 样品宜溶于稀释5~10倍的运行缓冲液中,以获得好的峰形。

6. 为提高定量准确性,宜加入一内标。在保证峰形的前提下,样品宜用高浓度,进样时间应大于5psi×sec。

7. 摸索实验条件时,可先用一短柱,用磷酸盐、硼砂或Tris在不同的pH值条件下试验,当选定缓冲液种类时,可先改变pH值获得最佳分离,再改变浓度以获得较好的峰形及柱效。为使分析高效、快速,电压一般可用18~20kv。

8.每次作完实验后,用水冲洗5min,可将毛细管两端置于水中保存,也可用氮气吹干后保存。
(责任编辑:泉水)
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