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包涵体的纯化和复性总结(2)

时间:2006-01-11 16:10来源:Internet 作者:bioguider 阅读:

10、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功
问:最近在做GST融合蛋白的纯化,由于目的蛋白主要存在于包涵体中,所以在变性条件下将包涵体溶解,经复性,透析后用GSH sepharose 4B纯化,结果得到了比较纯的融合蛋白,这是否说明GST的活性已得到恢复(因为能与GSH结合),请问这种情况下,是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢复?由于我的目的蛋白只是一个蛋白的某一段,不具有酶活性,也不是什么受体之类的,所以不知如何鉴定它的活性。

如果我得到的是变性的融合蛋白,那么用于制备多抗或者单抗会有影响吗?

如果我的融合蛋白是可溶性的,那么用GSH sepharose 4B纯化得到的融合蛋白可以直接用于制备多抗吗?溶液中的GSH,Tis等成分对免疫动物有影响吗?是否需要透析除取这些成分才能去免疫动物呢?

答:1)。不可以。GST 具体多大忘记了,但做为TAG 使用的蛋白一般是很小的一段AA,可以用相对应的抗体做PULL DOWN,亲和纯化等。但蛋白的活性是需要构象存在的,一小段TAG 空间结构几乎没有,就算是没有恢复活性的蛋白也可以与这小段AA 对应的抗体结合。

2)。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物,用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的,如果用来检测天然蛋白,可能会有假阳性。做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部,是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

3)。免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下,缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大,可以不用考虑。 
4) GST为26kd,你得到的蛋白活性应通过 目的蛋白功能分析才能验证是否复性。GST融合蛋白可以免疫动物,但抗体纯化须用GSH-sepharose 4B 和蛋白A或G进一步纯化,去掉抗GST抗体,如果你的目的蛋白很大,可以凝血酶切割除去 GST,再免疫动物.GSH,Tris 是小 分子,没影响。 
5) 既然目的蛋白没有活性,何来得活性鉴定,复性是否成功,就主要是看是否恢复到原来特有的三级结构,这就要看你目的蛋白的特异性,和天然的目的蛋白片断进行比较,看其复性是否彻底,这必须有个对照,才能知道复性是否完全。不知道你得到目的蛋白有什么用处,如果是用来做抗原,就没有必要进行活性鉴定了。
变性的融合蛋白做抗原是没有影响的,gst的分子量是26kda,当然,如果将融合伴侣除去,抗体的特异性会要更好一些,如果不除,影响也不会很大。最好进行透析,除去溶液中的杂物质,但是Tris没有什么关系,其就如同PBS一样,本身是缓冲体系,不会对免疫造成太大影响。 
6) 做抗原的话,变性了没关系的;纯化后可以直接免疫动物,我们这就有人做,不过他是用的His融合表达;挂着GST挺好的,不切也行,蛋白大些岂不是抗原性更强些
另外,你看没看过菌液上清里的蛋白量?那里可能有许多的有活性的蛋白呀


五、包涵体的纯化
复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似,这里不再赘述。(注:当然也可以先纯化然后再复性———一般多采用凝胶柱,或者纯化与复性同步进行———比如柱上复性。)

六、包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性

包涵体:
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集,形成无活性的固体颗粒。

包涵体的组成与特性:
一般含有50%以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等,环状或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,大小为0.5-1um,难溶与水,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

包涵体的形成:
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子,或环境不适,无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确的配对,过多的蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体,而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类,致使中间体大量积累,容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

包涵体表达的有利因素:
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击,包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度,有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低,且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离,有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感,易于破壁,并与细胞膜碎片分离。

破菌:
1、机械破碎
2、超声破碎
3、化学方法破碎

分离:
1、离心:5000-20000g15min离心,可使大多数包涵体沉淀,与可溶性蛋白分离。
2、过滤或萃取方法:

洗涤:
由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起,在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体,通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

溶解:
常用的变性剂有尿素(8M)、盐酸胍(GdnHCl6-8M),通过离子间的相互作用,破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差,异氰硫酸胍(GdnSCN)最强。

去垢剂:如强的阴离子去垢剂SDS,可以破坏蛋白内的疏水键,可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。

极端pH:可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
变性剂的使用浓度和作用时间:一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0,尿素在碱性环境中不稳定,一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜,但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。

还原剂:
由于蛋白间二硫键的存在,在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT,也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下,可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关,而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响,如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶,有时还原剂的使用也是必要的,可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

复性:
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始,到2M左右时结束。对于盐酸胍而言,可以从4M开始,到1.5M 时复性过程已经结束。

复性中常采用的方法有:
稀释复性:直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制。
透析复性:好处是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,有人称易形成沉淀,且不适合大规模操作,无法应用到生产规模。
超滤复性:在生产中较多的使用,规模较大,易于对透析速度进行控制,缺点是不适合样品量较少的情况,且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
柱上复性:是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法,如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。

还原剂的去除:
还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除,使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的,可以考虑在变性剂完全去除之后,在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。

常用的氧化方法有:
空气氧化法:在碱性条件下通空气,或者加入二价铜离子,能够取得更好的效果,缺点是不易控制氧化还原电势。
氧化还原电对(redox):常采用GSSG/GSH,通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势,也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如:5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。

复性的效率:
复性是一个非常复杂的过程,除与蛋白质复性的过程控制相关外,还很大程度上与蛋白质本身的性质有关,有些蛋白非常容易复性,如牛胰RNA酶有12对二硫键,在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上,而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11,很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来,蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度,变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

复性过程的添加剂:
1、共溶剂:如PEG6000-20000,据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团,此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会,也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右,具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶(PDI)和脯氨酸异构酶(PPI):PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合,从而有利于恢复到正常的结构,此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量,常常是复性过程中的限速步骤,而PPI的作用是促进两种构象间的转变,从而促进复性的进行。
3、分子伴侣,即热休克蛋白(HSP),是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子,研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株,据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg:成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中,可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等:增加黏度,减少分子碰撞机会,一般使用浓度在%5-30%。
6、一定的盐浓度,可能是为了降低某些带电集团间的斥力,有利于蛋白质的折叠。
7、辅助因子:添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
8、色谱法:通过将目标蛋白结合到层析柱上,减少蛋白分子间的相互影响,该方法得到越来越多的应用,常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。

当然,虽然有很多所谓的理性的复性方案设计,目前的复性工作更多的是一个经验的过程,没有一种通用的方法可以套用。

复性时的蛋白浓度:
一般使用浓度为0.1-1mg/ml,太高的浓度容易形成聚体沉淀,太低的浓度不经济,而且很多蛋白在低浓度时不稳定,很容易变性。

复性效果的检测:
根据具体的蛋白性质和需要,可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1、凝胶电泳:一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质,或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等,利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测,但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法:如IEX、RP-HPLC、CE等,由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4、生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定,较好的反映了复性蛋白的活性,值得注意的是,不同的测活方法测得的结果不同,而且常常不能完全反映体内活性。
5、黏度和浊度测定:复性后的蛋白溶解度增加,变性状态时由于疏水残基暴露,一般水溶性很差,大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法:如ELISA、WESTERN等,特别是对结构决定簇的抗体检验,比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

几个复性的实例:
1、MHCII JBC 269(47):1994
增溶:16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.
复性:8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.
2、增溶:10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.
复性:10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr,开口透析8hr,对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。
3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。
增溶:7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.
复性:稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次,温度4度。

纯化:
一般说来,复性液的体积较大,为了减少处理体积,在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀,沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高,可以直接进行HIC纯化,目标峰经适当稀释后(cond<5mS/cm)进行IEX纯化,然后通过SEC脱盐,更换缓冲液,除菌过滤后,在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。
当然在复性浓度较高的情况下,也可以直接将复性液进行IEX纯化,优点是在纯化的同时进行体积的浓缩,为以后的精制创造条件。
从生产的角度看,由于每增加一步纯化工序便降低很多收率,所以可过两到三次柱纯化,工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则,对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白,不得不进行多次纯化。

(责任编辑:泉水)
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