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铁蛋白免疫电镜技术

时间:2004-12-03 20:16来源:本站原创 作者:admin 阅读:

铁蛋白免疫电镜技术



(一) 原理
免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体,再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查,观察到铁蛋白抗体所在的位置,即抗原所在。
(二)材料与试剂
1.马脾铁蛋白
2.硫酸铵
3.硫酸镉
4.双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁,配制后放置4℃数天,以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC的多聚体形成,应重配。
5.0.30Mol/L pH 9.5硼盐酸缓冲液
6.0.1Mol/L硫酸铵液
7.0.05Mol/L pH 7.4 PBS液
(三)操作方法
1.铁蛋白的提取
⑴ 配制2%硫酸铵液,并以1Mol/L的NaOH或HCl调pH值,正好为5.85。取1g铁蛋白溶于100ml的2%硫酸铵液中。
⑵ 加入20%硫酸镉,使最终浓度为5%,混匀,4℃过夜。
⑶ 1 500g离心(4℃)2h,去上清。仍加2%硫酸铵至100ml,混匀,离心,去除不纯沉渣。
⑷ 于上清液中重新加入20%硫酸镉,重复步骤⑵,离心,去上清。
⑸ 检查沉渣,置显微镜下检查,应具有典型的黄褐色结晶,结晶为六角形,双一四点结构,如结晶不典型,应继续重复以上步骤。
⑹ 以少量的蒸馏水溶解,再加50%饱和硫酸铵溶液,使之沉淀,离心,去上清。
⑺ 重复步骤⑹一次。
⑻ 以少量蒸馏水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。
⑼ 100 000r/min离心2h,去除上部无色上清液(约3/4总量),置4℃过夜。
⑽ 用微孔滤膜(孔径0.45μ)过滤,使铁蛋白含量为65mg/ml~75mg/ml,分装,4℃保存不要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏。
2.铁蛋白-抗体交联法
⑴ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20mg/ml~25mg/ml。
⑵ 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45min,离心去沉淀。
⑶ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5mg/ml,以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白-XC液,4℃搅拌48h。
⑷ 以0.1Mol/L碳酸铵溶液透析过夜,以除去多余的异氰酸盐,再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析,使pH值恢复到生理水平。
⑸ 超速离心 以1.00×105g离心5h,去上清,沉淀以0.05Mol/L PBS悬浮,再次离心,以除去未结合的IgG。
⑹ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应,如果操作步骤严格,结果是满意的。
3.铁蛋白-抗体结合物处理标本
(1)将标本以5%福尔马林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min~60min。
(2)用冷的PBS液洗涤,离心。
(3)如是组织块,则在解剖显微镜下切成更小块,放入试管中,加入铁蛋白-抗体结合物置室温20min,不时振荡,
(4)以冷PBS液洗涤三次,离心。
(5)沉淀以2.5%戊二醛固定20min,以PBS洗涤。
(6)再以锇酸固定,脱水包埋。
也可以先超薄切片,再进行铁蛋白-抗体结合物染色。操作如下:
⑴ 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。
⑵ PBS液洗涤离心。
⑶ 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中,再将袋置于吸水剂粉末上,待牛血清白蛋白成胶状物时,将透析袋移至2%戊二醛PBS液(pH7.5)中固定3h。
⑷ 取出,切成小块,以PBS液洗涤。
⑸ 置干燥器中以硅胶干燥。
⑹ 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。
⑺ 滴一滴铁蛋白-抗体结合物于载网上。
⑻ 5min后,浮网于PBS液面,标本面向下,以除去多余的结合物。
⑼ 凉干后,滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。
⑽ 水洗、晾干、电镜观察。
(四)结果判定
在已知对照样品成立的前提下,凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在,判定阳性(+),否则判为阴性(-)。

(责任编辑:泉水)
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