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多肽小常识

时间:2004-12-21 10:03来源:本站原创 作者:admin 阅读:
多肽的基本常识
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大多肽在-20℃很稳定,特别是冷冻干燥并保存在干燥器中,在将它们暴露于空气之前, 冷冻干燥多肽可以放于室温。这将是湿度影响减少,当无法冷冻干燥时,最好的方法是以小的工作样量存放。
  对于含Cys, Met orTrP的多肽,脱氧缓冲剂对其溶解必不可少,因为这种多肽可易空气氧化, 在封瓶前,慢慢流过多肽的氮气或氩气也会降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽也容易降解,所有这些肽与不含这些有问题解苷的那些肽相比,生命期有限。

溶解性:
  
大多肽的道选溶剂是超纯抽气水。稀乙酸或氨水分别对于碱性或酸性多肽的溶解很重要。这些方法不溶的多肽, 需要DMF、脲、guanidiniam chloride或acetonitnle来溶解,这些溶剂可能某些实验有副作用。所以我们建议设计多肽时要加注意。
  残基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val将全增加多肽的溶解难度。
  您需要特殊的多肽或任何技术帮助,请随时与我们联系。 我们包你完全满意,对于我们不能适当合成的顺序,我们不收费。

多肽的保存和操做

  
包装 1mg或更少的多肽按净重包装,声明的小瓶重不含相关抗离子和水。 例如,氨基酸分析决定的肽含量是80%, 在1mg样品中,那么瓶中毛重是1.25mg。
  大量的多肽以毛重算。标出的重量含相关抗离子和水, 例如,25mg样品中肽百分比为90%,那么,实际肽量为25mg×90%=22.5mg
  不要把肽含量和纯度搞混了。肽的纯度可能是100%, 而肽含量相关带电基团(如Arg, Lys )的抗离子量和肽新水性决定。这是合成肽的本身特性。

冻干肽的保存
  
所有产品应存于冰箱, 最好为-20℃。多数肽以此方法可以存放几年不变。

肽溶液的保存
  
溶液肽远比冻干形式不稳定,溶液应为中性pH(pH5-7), -20℃保存的,为避免样品的反复冻融, 最好分成小样存放。一份样品融冻后未用完, 应扔掉,细菌降解有时会成为溶液肽的麻烦, 为克服此,肽应溶于无菌水, 或肽溶液用0.2μ M滤膜过滤。

多肽的重建和操作

  
多数肽溶于无菌蒸溜水。初次溶解时,要注意使初始浓度比要求浓度大,如果多肽仅有限溶解性, 这便允许加入其它溶解剂或缓冲盐。
  如果多肽在水中的溶解性有限,有几种选择可帮助溶解:
  对碱性肽用稀乙酸(含Arg , Lys , His)
  酸性肽用稀氨水(含Asp, Glu)
  对极疏水的肽用10%有机修饰物(Acetonitnile , Methanol)
  极不溶的肽用DM50或DMF
  guanicline hydrochloride或脲的浓溶液也很有用, 与上述方法合用, 声处理也是溶解多肽的有效手段。

多肽的包装
  
目录中所有多肽除特别说明外,纯度为95~98%。包装为小瓶冻干粉。 除特别注明外,多肽净重包装, 例如,1mg瓶的β-amyloid 1-40精确含1mg的多肽。多肽净重由氨基酸分析得到的肽含量计算。例如, 一个多肽样品毛重5mg,氨基酸含量85%, 多肽净重为5mg×0.85=4.25mg。请注意, 多肽含量不是多肽纯度,与抗离子象乙酸盐和溶剂,特别是水结合量合成多肽的本身特性。多肽纯度可能达100%, 但合成品中多肽含量由氨基酸组成,硫水性, 和多肽对溶剂和离子的暴露决定,特别是在纯化过程中, 无论多肽如何纯,冻干粉多肽含量一般为70-85%。 剩余15-30%由其它基本非肽成份构成。

多肽应用和保存
  
多肽具广泛的溶解性。多肽不溶的主要问题是形成二级结构。除了最太肽外,这点都会发生, 在有多重疏水残基的肽中更显著。盐会促进二级结构形成。我们建议先在无菌蒸馏水或去离子中溶解多肽。如需要增加溶解率, 可用声处理。溶解仍有问题, 加少量稀乙酸(10%)或氨水,会便于溶解。
  要长期保存多肽, 最好冷冻干燥,冷干粉可在-20℃或更低存放几年而很少或无降解。溶液中的多肽远不稳定。 多肽易受细菌降解,应用无菌纯化水溶解。
  含有Met, Cgs或Try残基的多肽溶液由于氧化,寿命有限。应溶于无氧溶剂, 为防止重复冻融的破坏, 建议溶解过量的肽的便实验,其余多肽以固体形成保存。

固相多肽合成Fmoc方法

  
任何多肽链的关键连接为肽键,由一个氨基酸的氨基与另氨基酸的缩合形成。通常一个氨基酸由一个中心碳原子组成,它由四个基它基团包围: 氨基、羰基、基和侧链。 侧链,称为R,区别不同氨基酸的结构。某些侧链含有干扰肽键形成的功能团。因此侧链功能团的封闭很重要。
  图工显示了Fmoc合成的一般流程,首先第一个Fmoc氨基酸通过一个酸性接头接到不溶载体树脂上,Fmoc去保护通过用碱处理树脂来完成,一般是Poperidine。 用预先激活或原位激活连接第二个Fmoc氨基酸。要求总多肽合成后,通过TFA分离来除去树脂和去保护。

Fmoc分离

固相多肽合成中多肽分离主要用酸解

Fmoc法用弱酸,比如TFA或TMSBr。各种添加剂, 一般为thiol compound , 水和酚,用来保护多肽的免分离中Carbocation的破坏。

下列保护基与TFA和TMSBr分离相合:(略)

基于保护基团的类别,必须使用去保护剂的组合。 例如, 当Boc和tButyl存在时,它们的Carbocation对应物能与Trp, Tyr和Met反应形成tbutyl产物。EDT是极有效的t-butyl trifluoroacetate清除剂, 但它不保护Trp。 因此,必须加水以控制烷基化。Trp的吲哚环和Tyr的OH极易与Pmc反应。水再次表现出对此反应的抑制。Trt和Mtr基团也有相似情形。较此适当组合清除剂将极大降低副反应。

tBoc和CBZ多肽合成

tBoc合成法见图3

tBoc法的分离法

Boc使用强酸,比如HF,TFMSA或TFMoTf。分离加入各种添加剂, 一般为thiol化合物以保护多肽免受carbocation破坏。

HF分离法(如下)略

TFMSOTf分离

TMSOTf分离

SPPS的一般连接方法

适于固相多肽合成的连接反应要求酰化反应,对同源多肽最有效。

Fmoc SPPS连接方法 FmocSPPS最常用的连接法是活性酯, 要么原位,要预先激活。 起初P-nitrophenyl和N-hydnxysuccinimide激活酰是常用形式。 甚至,有HOBt时,连接反应也很慢, 此外,Fmoc氨基酸ONSu、酯与succinimido-carbonyl-β-alanine -N-Hydroxysuccinidide酯副产物的形成相关。今天最常用的激活酯是Opfp和Odhbt。有HoBt时反应速度极快,副产物少。

另一方面, 使用象DCC,HBTU,BOP,BOP-Ce,或TBTU活化剂时, 能原位进行许多连接反应。Carbondiimide的直接添加是最佳选择。 然而,TBTU和HBTU第二个出现,接着BoP, 最后是BoP-CE。再者, 酯连接发现BoP/HoBt>Carbodiimido/HoBt> Carbodiimido/ODHbT> Carbodiimide/Opfp。

最近以来,HOAt和其对应Uronium盐同类物HATU的发展,发现此HoBt和HBTU具更强催化活性, 结果是增加连接产出,缩短连接时间, 消旋降低。 故此,更适合阻位氨基酸的连接,使得难合成肽的合成更成功。

tBoc SPPS的普通连接法

Carbodiimides, 主要是DCC是使用多年的连接试剂,主要的问题是激活和酰化过程中dicyclohexylurea的沉淀。并且伴有许多副反应, 已有几种产生可溶脲的Carbodiimide,例如DIC, t-butylmethyl-和t-tatyllethyl-carbodiimide, 但是这些试剂未解决副反应的问题。结果生产出了新的激活剂。 首先是BOP,随后是PyBrop, PyBOP, HBTU, TBTU和HATU。所有前述试剂都要活性碱基。

所有前面讨论的DCC及其衍生物都通过对称酐的形成起作。通常, 对称酐反应性极强已广泛用于SPSS,特别t-Boc合成中, 对称酐整合入Fmoc氨基酸有一些困难,例如,从N-(3-dimethylamino propyl ) -N?/FONT>-ethyl -carbodiimides -HG制备的对称酐, 由于Z-alkory-5(4H)-oxayolne中间体的形成, 在Carbodiimidie和tertiany amines存在时重排, 还有, 不是所有的Fmoc 对称酐都溶于DCM,或者无论所有试剂如何都不溶。

对称酐的另一种改变是混合酐,Carboxglic-Carbonate或Carboxglic-phosphinic混合酐, 典型的情况且是, 由活性isobutyl-或isopropyl-choroformate制备这些, 用Nox被阻氨基酸代替phosphinic chloride。通常反应迅速及少或无有副反应。

混合酐,N-carboxy酐(NCAS), 也叫,Leuch酐,已广泛用于多聚氨基酸制备,这类化合物联合Nox保护和活化炭基,一旦和另一个氨基酸或肽残基反应, 释放CO2做为副产物。

用光气处理α氨基酸很容易得到NCA衍生物,在严格调控条件下, NCA衍生物常结晶析出,便可使用。这些条件要求严格控制合成中的PH,在PH值低于10时,NCA和肽或氨基酸残基反应产物,肽-Carbamate易失去CO2形成自由α-氨基端, 发生聚合。pH10.5时,NCA便水解隆解。 所以反应在PH10.2条件下进行。别的条件要求是反应在0℃进行2分钟,要强烈搅动。 反应产物老消旋, 带有自由α-氨基,可以增加另一个酐而延伸。

液相合成
  
基于将单个N-α保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上,合成一步步地进行, 通常从合成链的C端氨基酸开始,接着的单个氨基酸的连接通过用DCC,混合炭酐, 或N-carboxy酐方法实现。Carbodiimide方法包括用DCC做连接剂连接N-和C-保护氨基酸。重要的是, 这种连接试剂促接N保护氨基酸自己炭基和C保护氨基酸自由氨基间的缩水,形成肽链, 同时产出N,N?/FONT>-dyaylcohercylurea副产物。 然而, 此方法因其导致消旋的副反应,或在强碱存在时形成5(4H)-oxaylones和N-acylurea而受到影响。庆幸地是, 这些副反应能最小化,如果还不能完全消除。方法是加入象HoSu或HoBT这样的连接催化剂, 此外,此方法也可用于合成N保护氨基酸的活性酯衍生物。依次产生的活性酯将自发与任何别的C保护氨基酸或肽反应形成新的肽。
  当从副产品, diaydohexylurea分离活性酯有困难时,可用混合Carbonic酐方法, 此方法由两步组成,第一步是在有tertiary碱的有机溶剂中用适当的酰基氯激活Nx保护氨基酸的炭基,第二步是让肽或氨基酸的自由氨基与Carbonic酐反应。Carbonic酐通常加到自由氨基的14倍。
  虽然此方法在低温时高效高产,产品纯, 但也有其缺点, 例如,由羰基的强激活酐衍生物有消旋倾向。然而此问题在使用Nx-α-Urethane保护基(Cb2, 或tBoc)时便不会发生。进一步: 由于高反应性, 混合Carbonic酐 倾向5(4H)-oxagolomes, Urerbanes diacyimide, 酯的形成, 并易失调。
  促进这些副反应的条件是高温,延长激活时间(即,混合酐形成后, 加到alkylchlorocarbonate和amine成份的时间,amine组成的空间占位,平共处和混合酐的不完整形成。幸运的是, 大多这些副反应, 除形成哑唑酮和脲烷外,可通过低温进行反应(~-15℃),大为减少,并且缩短活化时间(~1-2分钟)。为了使哑唑酮和尿烷形成最少,要实行如下措施:1)必要性须用无水有机溶剂,乙酸,四氢 喃,t-butand, 或acetonitrile; 2) 应使用tertiary碱和N-methglmorpholine;3) 必须用C b2或tBoc N- α保护氨基酸。
  虽然用isobutyl-和ethylchlorocarbonate常用来形成羰酐, 但确有别的连接试剂,例如,EEQD和IIQD用来与CarboxaP成份反应形成erhyl-或isobutyl carbonate衍生物。 不同于传统酐程序,EEQD和IIQD不要求碱,也不要求低温,通常要求一种有机溶剂(有许多也用)中0.1-0.4M浓度的等摩尔量的羰和氨成份。之后EEQD或IIQD多加5-10%, 温合液室温搅拌15-24小时。真空除去溶剂后,残留物溶于乙酸, 用1NHaHCO3 , 10% 枸橡酸和盐水洗剂,之后用无水Na2So4干燥,蒸发,产品可以重晶结或层析纯化。
  这种方法避免了用碱,但仍有消旋和尿烷副产物,水平与经典相当。 所以优势中于容易方便,但应注意,两种方法的详细比较,目前为重仍未有。

HPLC分析和纯化
  
分析HPLC使用柱子和泵系统,可以经受传递高压,这样可以用极细的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。
  HPLC分两类:离子交换和反相。 离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸组成表现出相反电荷。 分离是一种电荷相互作用,通过可变PH, 离子强度, 或两者洗脱出多肽,通常, 先用低离子强度的溶液,以后逐渐加强或一步一步加强,直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。
  反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上,用降低离子强度洗脱, 如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成,这种链长度为G4-G8碳原子。 由于洗脱是一种疏水作用。长链柱比短链对小的, 高带电肽好。另一方面大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而,总体实践中, 这两类柱互变无多少显著差别,别类载体由碳水化合物构成, 比如苯基。
  典型的操作常由两绶冲剂组成,0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱,那么大小是8×100(3-10μ m)和25×250mm(10μ m)
  大量各种缓冲剂含许多不同试剂,比如heptafluorobutyric酸,0.1%磷酸, 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸钠/氨,TFA/TEA,磷酸钠或钾,异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂,但要注意一点:硅反相柱料不能长时间暴露于高pH,甚至微碱pH, 因为这样会破坏柱子。

纯化
  SPPS提取的粗肽含许多副产物,早期的纯化方法包括离子交换,分溶和反溶注析, 更现代的方法是反相HPLC,一般于60残基或更少的肽很成功。 当反相HPLC失败时,可按合离子交换HPLC。
  通常分析HPLC结果用于决定纯化条件。例如,一种太肽用30%(0.1%TFA)acetonitrile洗脱出, 这是分析HPL定出的。那么选择acctonitrile浓度更低的缓冲液使得在isocratic条件下(比如28%,0.1% TFA acetonitrile)多肽在溶剂保持时间4-5分钟后洗脱。这样, 根据柱子类型, 我们的纯化条件用16-35%(0.1%TFA) acetonitrile线型梯度, 在一两小时内完成,之后用分析HPLC查检各种比例,使用我们isocranic条件选定的缓冲液。

(责任编辑:泉水)
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