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原位杂交操作规程

时间:2005-01-06 12:11来源:本站原创 作者:admin 点击: 1519次

原位杂交操作规程

 (一)、仪器设备
     医用微波炉;
水浴锅。

     (二)、试剂
     0.2mol/L HCl
HCl 8.2mlH20 定容0.5L0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33mlH20 定容0.4L.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2mlNaCl 5g,浓HCl 4mlH20 定容0.98L,醋酸酐 (用前加)2.5ml20×SSC(pH7.0)NaCl 175.3g,枸橼酸钠 88.2gH20 定容1L100×Denhardt'sFicoll 1gPVP 1gBSA 1gH20 定容50ml杂交液:Formamide 5ml20×SSC 2.5mlDextran sulfate 1g100×Denhardt's 0.5ml10%SDS 0.5ml10g/L sperm DNA 0.1mlH20 1.4LBufferⅠ(pH7.5):0.1mol/L ris·Cl0.15mol/L NaClBufferⅢ(pH9.5):0.1mol/L Tris·Cl0.1mol/L NaCl0.05mol/L MgCl2BufferⅣ(pH8.0):10mmol/L Tris·Cl1mmol/L EDTA 

    
(三)、操作流程
    1
、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天
    
1 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟;
    
2 无水乙醇浸泡2次,每次3分钟;
   
3 95%乙醇浸泡2次,每次3分钟;
    
4 PBS清洗3分钟;
    
5 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;
    
6 PBS清洗10分钟;
    
7 加入胃蛋白酶25ul/ml37℃孵育15分钟;
   
8 PBS清洗2次,每次3分钟;
    
9 0.2NHCl孵育30分钟;
    
10PBS清洗2次,每次3分钟;
    
110.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;
    
12PBS清洗2次,每次5分钟;
    
13)预杂交缓冲液孵育30分钟;
    
14)准备核酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针,85℃加热5分钟,置于冰块中10分钟;
    
15)杂交;第二天
    
16)将玻片置于SSC2次,每次5分钟以去除封片;
    
17PBS清洗3分钟;
    
18RNAA溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中),37℃孵育30分钟;
    
19PBS清洗5分钟;
    
20)室温,2×SSC清洗10分钟;
    
2137℃,1×SSC清洗10分钟;
    
2237℃,0.5×SSC清洗10分钟;
    
23)缓冲液A孵育10分钟;
    
24)缓冲液A1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟;
    
25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液,来自Boehringer Mannheim),37℃孵育3 小时;
   
26)缓冲液A清洗2次,每次10分钟;
    
27)缓冲液B清洗2次,每次5分钟;
    
28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可延长到16小时;
    
29)停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗;
    
30)固红,脱水以及封片进行核的复染。
    
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天
    
1 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟;
    
2 无水乙醇浸泡2次,每次5分钟;
   
3 95%乙醇浸泡2次,每次5分钟;
    4 PBS清洗5分钟;
    
5 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;
    
6 PBS清洗5分钟;
    
7 加入胃蛋白酶25ul/ml37℃孵育10分钟;
   
8 PBS清洗2次,每次5分钟;
    
9 0.2NHCl孵育30分钟;
    
10PBS清洗2次,每次5分钟;
    
110.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;
    
12PBS清洗5分钟;
    
13)预杂交缓冲液孵育30分钟;
    
14)准备寡核苷酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针;
    
15)杂交;第二天
    
16)将玻片置于SSC中以去除封片;
    
17)室温,2×SSC清洗10分钟;
    
1837℃,1×SSC清洗10分钟;
   
 1937℃,0.5×SSC清洗10分钟;
    
20)缓冲液A孵育10分钟;
    
21)缓冲液A孵育30分钟;
    
22)加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时;
    
23)缓冲液A清洗2次,每次5分钟;
    
24)缓冲液B清洗2次,每次5分钟;
    
25)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可长到16小时;
    
26)停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗;
    
27)固红,脱水以及封片进行核的复染。  

(责任编辑:泉水)
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