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cDNA文库构建策略及其分析研究进展

时间:2006-02-14 09:28来源:云南农业大学学报 作者:bioguider 点击: 982次
  自20世纪70年代中期首例  cDNA  克隆问世以来,构建  cDNA  文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。cDNA  便于克隆和大量表达,它不像基因组含有内含子而难于表达,因此可以从  cDNA  文库中筛选到所需的目的基因,并直接用于该目的基因的表达。通过构建  cDNA  表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源,而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针,更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此,cDNA  在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势,从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值,是研究工作中最常使用到的基因文库。  



  从1976年  HOFSTETTER  成功的构建了第一个  cDNA  文库以来,构建  cDNA  文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期  cDNA  文库,由于当时技术的限制,选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点,而  YOUNG  和  DAVIS  重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。近年来,cDNA  文库构建的新方法层出不穷,但其共同目的是使  cDNA  文库更加迅速、高效满足研究的需要。本文就近年来发展的  cDNA  文库的构建及其类型特点作一简要综述。  



1  cDNA  文库的构建  



1.1  cDNA  文库构建的基本原理与方法  



  cDNA  文库是指某生物某发育时期所转录的全部  mRNA  经反转录形成的  cDNA  片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典  cDNA  文库构建的基本原理是用  Oligo(dT)  作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的  cDNA  加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括:RNA  的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的  cDNA  文库,获得高质量的  mRNA  是至关重要的,所以处理  mRNA  样品时必须仔细小心。由于  RNA  酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无  RNA  酶的环境对于制备优质  RNA  很重要。在获得高质量的  mRNA  后,用反转录酶  Oligo(dT)  引导下合成  cDNA  第1链,  cDNA  第2链的合成(用  RNA  酶  H  和大肠杆菌  DNA  聚合酶  I,同时包括使用  T4  噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌  DNA  连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链  DNA  克隆到载体中去、分析  cDNA  插入片断,扩增  cDNA  文库、对建立的  cDNA  文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择,常规用的是  λ  噬菌体,这是因为  λ  DNA  两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源  DNA。  



1.2  cDNA  全长文库  



  经典  cDNA  文库的构建虽然高效、简便,但文库克隆的片段一般较小,单个克隆上的  DNA  片段太短,所能提供的基因信息很少,大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的  cDNA。为了克隆到真正的  cDNA  全长,建立富含全长的  cDNA  文库具有重要意义。为此,必须克服仅用  mRNA  的  PolyA  尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长  cDNA  文库,是指从生物体内一套完整的  mRNA  分子经反转录而得到的  DNA  分子群体,是  mRNA  分子群的一个完整的拷贝。全长  cDNA  文库不仅能提供完整的  mRNA  信息,而且可以通过基因序列比对得到  mRNA  剪接信息,此外,还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。目前所报道的对全长文库的构建一般按照美国  CLONTECH  公司的  SMART  cDNA  Library  Construction  Kit  方法或  GeneRacer  试剂盒  (Invitrogen,USA)  使用说明进行。判断一个  cDNA  文库中的  cDNA  序列是否是全长基因的  cDNA,主要方法有以下几种。  



1.2.1  直接从序列上评价  



  5'端:如果有同源全长基因的比较,可以通过与其它生物已知的对应基因5'末端进行比较来判断。如果无同源基因的新基因,则首先判断编码框架是否完整,即在开放阅读框的第1个  ATG  上游有无同框架的终止密码子;其次,判断是否有转录起始点,一般加在5'帽结构后有一段富含嘧啶的区域,或者是  cDNA  5'序列与基因组序列中经过酶切保护的部分相同,则可以确定得到的  cDNA  的5'端是完整的。3'端:同样可以用其它生物已知的对应基因3'末端进行比较来判断,或编码框架的下游有终止密码子,或有1个以上的  PolyA  加尾信号,或无明显加尾信号的则也有  PolyA  尾。   (责任编辑:泉水)
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