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核酸探针制备与非同位素标记新方法

时间:2010-09-10 07:12来源:未知 作者:admin 阅读:

 一、概述 
近年来核酸杂交技术在分子生物学、临床医学、细胞生物学、分子遗传学等学科领域中应用,得以飞速的发展。基因探针的制备技术及同位素、非同位素标记、检测技术则是基因诊断技术中的关键一环。而从70年代中期以来核酸探针杂交技术就已经在科研和临床中被广泛采用,成为一项直接检查病原体、癌基因和遗传病基因突变的重要手段,而采用的方法主要是用放射性同位素标记的探针来完成。80年代以后人们致力于非同位素标记技术的建立,其中应用最广泛的是生物素标记的核酸探针以及后来发展的以地高辛甙元为标志物,以抗体一酶系统显示的试剂盒。在生物素标记系列中,初期出现的是以Bio-11- dUTP替代TTP在缺口平移中掺入的标记法,随后又改进为随机引物掺入标记法,至1987年澳大利亚推出光敏生物素标记法之后,我们又进一步发展了长臂光敏生物素,使标记方法大为简化,不论双链或单DNA或RNA都可以标记。除临床医学外,应用的领域也越来越广泛。 
二、核酸探针的制备 
用探针进行基因诊断的关键首先是要取得探针。探针是一段有特定序列的,有一定长度(15个至近千个核苷酸)的核酸片段,也可以是完整基因,亦可以为其一部分;可以是天然序列,亦可以是人工合成序列,但必须加以标记。通过分子杂交来检查标本中的互补序列。 
核酸序列可以是克隆的,也可以是合成的,这主要是取决于核酸探针是否能满足特异性要求。如果有特异、或当DNA序列未知而又必须首先进行克隆,以便绘制酶谱和顺序时,常常应用克隆探针。克隆探针一般较寡核苷酸探针的特异性强,复杂性高,较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列的少,并可以获得较强的复杂信号。寡核苷酸探针技术是检测点突变的有效技术。使用该技术的前提条件是必须知道突变的确切位置,只要知道点突变的确切位置,即可人工合成对应于该位置在内的正常和突变的一对寡核苷酸(约20 个脱氧核苷酸左右)经末端标记后作为探针。除以上方法外,用PCR扩增产物制备探针,通过电泳分离回收可以得到纯度较好的一定长度的探针。现常用的方法还有直接用提纯的质粒进行探针的标记,这种方法较为方便,获得标记探针较为容易。总之,不论用何种方法得到的探针必须是纯度越纯越好,这样的探针被标记后,才能获得高纯度、高特异性、高灵敏度的标记探针(见表1)。 
表1    核酸探针的来源

三、探针的标记及检测 
用于杂交的基因探针必须先进行标记,最常用的是同位素标记和非同位素标记两大类。

使用放射性同位素标记的核酸探针,尤其是在用于常规临床诊断时,存在着有些放射性同位素半衰期较短,易环境污染,操作者个人安全,放射性同位素废物处理等问题。

由于这些限制,非放射性标记探针,在对生物特定核酸序列的定位及定量检测方面,得以迅速发展。

非放射击性标记探针具有令人瞩目的潜力,现以成为热门研究的一个课题(见表2)。 

表2    核酸探针的标记
 

分  类
方  法
特 点 及 应 用
酶促标记 缺口平移
随机引物
 
末端加尾
末端标记
 
逆转录掺入
体外转录
PCR
标记同位素
klenow DNA聚合酶,标记高比活性
单链DNA或RNA,常为α-32P
寡核苷酸标记
T4激酶(5')或TDT(3')端标记α-32P
用于短探针的标记
cDNA探针的标记
RNA探针的标记
掺入标记-32P或生物素
光促标记 光敏生物素
光敏地高辛
生物素补骨脂素
光DNP(2,4-二硝基苯)
溴钨灯12V,100W
 
紫外灯(365nm)
日光灯(275W)
化学修饰合成法 氨基(NH2)
硫基(SH)
5'-OH基
5'-磷酸基
化学合成
内部标记碱磷酶(AP)
5'标记辣根酶(HRP)
末端转移标记Bio-11-dUTP
乙二胺琥珀酰亚胺生物素
标记荧光素、生物素、微过氧化物酶等

 

 

(一)非同位素标记 

1 半抗原标记法 

  在核酸分子上用半抗原标记制备成免疫核酸探针,使之能用免疫学方法去检测。例如光激活的2,4-DNP作为标记试剂。它要求有一高度亲和的DNP抗体,由于检测中用抗体替代链霉亲合抗体检测,这些探针在原位杂交中的背景比生物素标记的探针要低。光敏DNP的缺点是由于应用抗体检测,检测时间较长。 

2 直接标记法 

  将特定酶或蛋白质直接标记在DNA分子上,然后以酶促显色反应或特异性蛋白质染色何等检测系统,现多用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。 

  还有以将蛋白质,如组蛋白直接标记到DNA分子上做探针,以印度墨水(India Ink)染色来检查杂交带。 

3 生物素标记法 

  将生物素(Biotin)连接在核酸探针上,利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理,分子杂交后用亲和素(Avidin)或链霉亲和素(Streptavidin)进行检测。酶一底物颜色反应检测:亲和素可以用酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光素或高电子密度(铁蛋白,胶体金等)的标志物标记。生物素标记探针稳定,不失活,并能配用多种检测系统,简单方便。 

  使用生物素进行核酸标记方法很多,其各有特点,下面简单介绍几种。 

(1) 酶学法 

  Richards(1983)使用T4 RNA连接酶,将生物素标记在RNA的3’端,Laeger等通过缺口翻译法,在酶作用下标上生物素.使用含有生物素基的UTP类似物,在酶促反应下,将生物素掺入DNA.此生物素标记的DNA探针,可与RNA或DNA进行原位杂交或在Southern印迹膜上进行杂交.近年来,寡核苷酸探针越来越引起人们的注意,展示了广阔的应用前景.寡核苷酸探针的主要优点是能区分单一核苷酸点突变顺序.能被用于分析发生单一碱基置换的基因.1984年Murasugi报道了一具23mer的寡核苷酸探针的酶促合成,这个探针的士’端具有一个含生物素基脱氧尿苷酸(Bio- dUTP).具体讲,Bio-dUTP通过E.Coli DNA聚合酶I进行引物延伸反应,标记到DNA 3’端,用这种方法,可以制备任何3’端带有一生物素基的探针.如能选择一个5’端有一个脱氧腺苷酸,而且与引物至少有3个互补碱基的模板,则可以使反应更加简单化. 

酶学法标记虽然成功了,但存在着许多缺点.不同的核酸需要不同的标记方案及不同的酶.并且对于大量探针的制备则需大量价格昂贵的酶和底物. 

(2) 化学法 

  用高碘酸盐氧化的化学途径,将生物素连接到RNA的3’端,或用戊二醛使生物素标记的组的蛋白H,与单链的核交联上,制成的探针(RNA-Biotin)可与含有编码该RNA基因顺序的单链DNA片段进行杂交,继之用适当方法进行检测.最近,生物素标记寡核苷酸探针已用化学方法合成,例如,柱上衍生法,MFOC-氨基接头5’-氨基寡核苷酸,可有以下几种标记和检测方法:5’-荧光素FTTC寡核苷酸非同位素测序,5’-生物素寡核苷酸磁性-AV单链片段反义核酸,长尾A-T标记寡核苷酸高灵敏度寡核苷酸探针,酶标寡核苷酸直接检测. 

(3) 光化学法 

  用光化学法将DNA用生物不共价标记获得了成功. 

a. 利用光敏生物素进行光化学法进行标记,与酶学法对生物素标记相比,具有快速、安全可靠、探针稳定主成本较低等优点,大量或少量均可制备。单链或双链核酸均可,DNA或RNA也均可。此外,标记的核酸易于纯化。由于被标记物标记后为红色,所以标记过程可被肉眼监测。由于后面专门设题介绍具体的光敏生物素标记、纯化及分子杂交技术,故不在此赘述。需指出,对于超大螺旋DNA(如质粒DNA)在标记过程中,应先超声剪切,然后再进行光标记效果会更好。 

b. 地高辛属类固醇半抗原,仅存在于洋地黄类植物中,其抗体与其他任何固醇类似物如人体中的性激不比无交叉反应,它不像生物素标记的探针那样,由于体内多有内源性生物素的存在而易出现非特异性染色。长臂光敏地高辛标记试剂是近年来发展起来的用光化学法进行探针标记的新试剂。国外的试剂盒相当昂贵,我们自己合成了长臂光敏地高辛,并组装成试剂盒,初步用于原位杂交取得成功,具有特异性高、低背景的特点,比光生及BCIP、NBP两种底,显蓝紫色斑点。该试剂在探针的标记及检测应用面较广,而且操作简单。 

c. 使用生物化的补骨质素(Psoralen)和M13载体。首先把与靶DNA顺序同源的序列克隆到M13载体局部形成双链,留下单链的杂交区域。双链已用含生物素基的补骨质素标记,具体做法是:通过紫外线照射,使补骨质素共价连到嘧啶基上形成生物素标记M13探针,杂交后可用逻霉亲合素与酶的复合物去检测。 

d. 最近又见有人用溴脱氧尿苷标记的探针,其敏感性与生物素探针相同,但可避免某些组织中内源性生物素引起的假阳性问题,此外,还可与生物素探针一起使用,开展双杂交方法。 (责任编辑:泉水)

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