(二)检测方法 

1 生物素检测 

　　着重介绍非同位素标记法的生物素化探针杂交信号的检测方法。对于生物素标记核酸探针的检测有许多方法。一般使用生物素一亲合素（Biotin- Avidin）。如前所述，亲合素分子上有四个与生物素结合的位点，利用二者之间高特异性的亲合作用进行检测。由于亲合素（Avidin）是一种糖蛋白，分子量67kD，在蛋清大量存在，故可从蛋清中提取。它包括四个亚基，每个为128氨基酸残基构成的多肽链，在该链中的10，20，43和110位点上共有四个色氨酸。每一亚单位上的糖基为一个低聚糖，含有甘露糖和氨基葡萄糖，最独特之处是亲合素（Avidin）分子表面有四个疏水口袋（每一亚单位有一个），该处即为与四个生物素残基特异结合的位点。生物素与亲合素之间的结合是非共价键结合，一旦结合，很难分开，除非在很低的pH条件下。所有利用生物素一亲合素的检测方法不外乎有以下几个原则： 

a 介于生物素与亲合素分子有异乎寻常强的亲合力，彼此间形成稳固的复合体； 

b 通过简单的生化反应可把像酶或抗体及核酸等大分子连接在生物素上； 

c 对亲合素可以标记上不同的标志，如酶、重金属或荧光素； 

d 也可以把亲合素当作桥，两头连接上不同的生物素化分子，如酶、核酸或抗体。 

　　然而亲合素（Avidin）有许多局限性： 

a 由于它的等电点（PI）是10，所以在pH接近中性时，带强正电荷，因而可与核酸或磷脂类等阴电荷分子以一种非特异方式结合。如作核酸原位杂交时，可产生非特异染色； 

b 由于亲合素是一种糖蛋白，可通过糖链部分与凝集素类生物分子起反应。这些非特异性反应妨碍了亲合素的广泛使用。为了克服上述缺点，采用了一些措施，如设法降低亲合素的高等电点（PI）。例如，并这种修饰后的亲合素仍含有糖链，难以降低背景染色。因此，有人索性放弃使用Avidin而改用抗生物素抗体与生物素发生连结反应。 

从链霉菌（Streptomyces Avidini）中提取一个分子量为60kD的蛋白Streptavidin，可取代前面所讲的Avidin。它同样是有四个与生物素高亲和合结合位点而不含糖链，其等电点为6，与中性pH接近，在生理pH或轻度碱性pH下仅带微量电荷。因此Streptavidin比Avidin更有实用前景，特别在核酸杂交技术中，运用胶体金标记的Streptavidin可以使原位杂交技术深入到电镜水平。生物素类标记探针进行分子杂交时，为避免产生高本底，可在操作中进行一些改进仍可以达到低背景。如在杂交液中加入一定量的牛血清白蛋白、甘氨酸或硫酸葡聚糖欠盐等。另外，增加封闭时间（最好过夜）也会和到一定作用。 
光敏地高辛标记核酸探针，操作方便、灵敏度高，已标记的探针在 4℃贮存可达两年之久，方便随时应用。用光标记法将光敏Dig标记到探针上，制成光敏-Dig-核酸探针，再与固定在硝酸膜上的靶核酸进行靶DNA分子杂交，使之与抗Dig-碱性磷酸酶结合，最后可用不同的检测方式进行检测，发光检测和显色检测均可，灵敏度可达0.1-1pg.用光敏地高辛标记探针,可以避免组织中(尤其是原位杂交)内源性生物素引起的假阳性问题或使本底增高的麻烦. 
2 半抗原检测 
检测半抗原标记探针的方法,是先使探针与抗半原抗体(第一抗体)结合,再与酶连接特异抗抗体(二抗)结合.探针与两个抗体之间的反应时间一定要控制好,时间过长、过短均会影响信号的强弱.最后仍用显色法检测探针杂交的结果. 
3 两步比色法检测 
生物素标记探针,与检测系统的链亲合素和生物素碱磷酶两步结合法进行检测,这样可以减轻本底,但又增加了操作的难度. 
4 化学发光检测 

化学发光检测也是近年来发展起来的检测手段,它需要一定的发光增强剂,并配有各自的过氧化物酶系统。主要是生物素探针与固定在硝酸膜（或尼龙膜）上的 DNA结合，生物素与亲合素，过氧化物酶（或碱磷酶）结合，再经过化学发光及增强作用，将光量放大后，在X片上发光自显影，将特异结合的DNA区带显示出来。化学发光检测敏感性高，但需要在暗室进行X光片曝光，并且操作要速度，时间要掌握适度，这样就增加了操作难度（见表3）。 
表3    分子杂交的显示系统 

四、核酸探针的应用 
(一) 鉴定特异性目的基因及外源DNA的检测 
在基因工程中，含有特异性目的基因的重组子，可通过核酸分子杂交进行鉴定。生物工程产品中残留的宿主细胞DNA是一种潜在的与工艺相关的杂质。各种产品中所含的残留DNA，取决于所用的突破主微生物（细菌或细胞）和生产该产品的回收工艺。例如：DNA或其降解片断，可以被阴离子交换剂（DEAE-Sepharose FF，Mono Q等）吸附，洗脱时混入到蛋白级分中。现虽还没有因使用含DNA的生物制品而影响人体健康的报道，但管理部门则要求生产者控制生物工程产品中的DNA含量，使之保持在低水平。我国卫生部制定了相应规定；美国药典、英国药典和世界卫生组织的文件均有相应的规程和方法；均要求每一剂量制品所含残留DNA的量不得大于100pg（10^-12 g），但测定方法并无具体细节。国内有些单位已开展了此项工作。我们采用非同位素法，以长臂光敏生物素标记核酸探针，通过分子杂交检测残留DNA。方法的检测灵敏度为2pg，符合100pg/剂量的标准要求。 
(二) 基因诊断方面的应用 
以基因探针杂交和基因体外扩增两项技术为主干，以转印、电泳、限制性酶切乃至DNA测序、基因拼接等技术为辅助，使基因诊断逐步成长为一套有广泛用途的、高灵敏度（ag级）、高特异性（能查明一个核苷酸的差异）的医学生物学诊断手段，不同模式的基因诊断可以随需要而任意选用，例如： 
(1) 斑点或条状杂交模式。适用于大批量标本的检测，如普查、献血员初筛等场合，每人每天的检测可以达到1000个标本以上，如果辅以半自动的样品处理、分子杂交仪等检测数则可增加数倍，对含多拷贝重复序列的疟原虫检测可达高灵敏度。 
(2) 探针杂交模式将不可替代地用于原位杂交、菌落或细胞群落的转印杂交筛选，用于检测片段中的点突变（示并差杂交），用作探针来亲和（杂交）分离含互补序列的片段等。 
(3) PCR-EB，PCR-SCB，套式二次PCR，套式一次PCR，则可用于需要不同灵敏度和特异性的检测。 
基因诊断的应用范围正在不断扩大之中，在以下几个领域中具有实用价值： 
(1) 遗传病的产前诊断。用胎儿羊膜细胞、羊水甚至母血可以检测胎儿的性别，这在与性染色体关联遗传病诊断中是必要的。对于高发的遗传病如地中海贫血、镰刀状贫血、凝血因子缺乏、DMD等已在临床应用多年，为优生优育作了贡献。对于有遗传倾向的疾病尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂症，甚至部分肿瘤，均是当前研究的重点，近期内可有突破。 
(2) 致病病原体的检测。这些外源入侵的基因，一旦阐明其部分核酸序列，就可以设计引物和探针，用PCR、 RT-PCR或杂交方法来检测，其范围包括细菌、病毒、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物。基因诊断的特点是可以其基因中的保守区做通用检测，也可以选定差异较大的基因部位做分型检测；即可以做单一病原体的专用检测，也可以将有关的病毒、细胞中不同的品种做一次多元检测，而且检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间已达到临床要求。这对于难以培养的病毒（如HBV）、细菌（如结核、厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。 
(3) 癌基因的检测和诊断。虽然对癌基因的研究大部分还属于基础阶段，但癌变是由基因变化所导致的这一基本事实已毋庸置疑。所以癌基因、抗癌基因及癌转移基因的研究，离开分子水平的诊断手段是无法进行的。临床上已可应用的例子有白血病残留细胞的定量（包括慢粒和急淋）；肺癌中p53及Rb等抗癌基因的失活；神经胶质瘤中N-mic基因的激活和表达。通过原位杂交观察特定癌基因及抗转移基因的植入和反义寡核苷酸对强表达癌基因的阴断均已成为近代基因治疗的着眼点。 
(4) DNA指纹，个体识别，亲子关系鉴别及法医物证。这一为公、检、法部门所瞩目的课题已经在某些国家取得法律认可。肌红蛋白小卫星体基因、珠蛋白基因、ApoB基因等的多态性和重复次数的差异都被应用于鉴定，其灵敏度已达到一根头发、一个细胞、一个精子取得个体特征图谱，这一领域也已发展到骨髓或脏器移植配型乃至动物种系的研究等。 
(5) 动、植物检疫。灵敏、特异、快速诊断检测方法是国进出口口岸的门卫。检查出入国门的人员、动植物（种畜、种籽）等是否携带烈性传染病（艾滋、动植物病毒等）病原体，食品、饮料等否带沙门氏菌等，均需要基因诊断手段将这些病菌拒之国门之外，基因诊断是提高我国综合国力的必要保证。 
(6) 高科技生物医学领域中的应用。在转基因动植物中检查植入基因的存在。PCR技术尚可提高我国综合国力的必要保证。 
随着基因诊断手段的日益完善，它的自动化已指日可待。届时它在临床应用中的地位也将发生明显改变，而将处于举足轻重的位置。 
 
参考文献  
1 吴冠芸主编.基因诊断.北京:人民卫生出版社,1988 
2 John F,Robyt et al.生物化学技术的理论和实验.吉林:吉林大学出版社,1991 
3 J.sambroek E.F.Fritsch T.Maniatis.金冬雁,黎孟枫等译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社,1993 
4 朱忠勇等主编.实用医学检验学.北京:人民军医出版社,1992 
5 林万明主编.核酸探针杂交实验技术.北京:中国科学技术出版社,1991 
6 王申五主编.基因诊断技术——非放射性操作手册.北京:北大协和医大联合出版社,1994 
7 刘妙良.地高辛配基标记的核酸技术.生物化学和生物物理进展,1992,19:34 
8 蔡文琴、王伯云主编。实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术，成都：四川科学技术出版社，1994