原理

  所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。

免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。

操作程序

(1) 随机引物标记操作程序如下：

①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。

②DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。

③加4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。

④置37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。

⑤加入2μ1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。

可根据下表估计标记产量：

(2)核酸探针膜上杂交原理和操作

（一）杂交总原则

脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。某些条件(如酸碱、有机溶剂、加热)可使氢键断裂，DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的核酸单链，DNA单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。

（二）杂交膜的选择

意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。

（三）探针浓度

探针浓度是获得理想杂交检测的关键因素，浓度太高则会导致本底太深；若浓度太低又会导致信号减弱。为了解决过高探针浓度所引起的高背景，必须进行模拟杂交实验。

所谓模拟杂交实验，即选择几小片杂交膜，在未转移DNA的情况下，进行封闭、不同浓度的探针孵育及随后的免疫检测。以背景能被接受的最高探针浓度为正式杂交实验的浓度。模拟杂交实验不 同浓度的探针可以参考下述方法配制：取5μl标记反应液加1ml探针稀释液，混匀。取0.5ml等倍释后，再取0.5ml继续等倍稀释。假设20μl标记反应液中含1μg标记的探针，则系列稀释探针的浓度分别是：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml。

（四）预杂交和杂交液

预杂交和杂交都使用相同缓冲液，不同的仅仅是预杂交液中不含有探针。下面是几种基本杂交液配方：

①Standard buffer: 5×SSC,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。

②Standard buffer+50% formamide∶50% formamide(deionized),5×SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02%?(w/v)SDS,2% Blocking Reagent。

③High SDS buffer(Church buffer):7%SDS,50% formamide(deionized),5×SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodium Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine

（五） Southern Blotting

DNA片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。1975年Southern发明了利用浓盐溶液的推动作用将变性的单链DNA转移到硝酸纤维素膜上的方法，解决了原位转移的问题。虽然其原理和操作均很简单，却是基因分析中必不可少的手段，已经得到了广泛的应用。?Southern印迹杂交包括两个主要步骤①把电泳分级的DNA转移到固相支持膜上。②与标记的DNA探针杂交。

1． Southern转移

首先将DNA用限制性内切酶消化。准备一定浓度的琼脂凝胶。琼脂凝胶必须是高纯度和核酸级的。电泳后经溴化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下，放入搪瓷盘中，然后进行下面的步骤。

试剂

a.0.25M HC1

b.变性液：0.5N NaoH,1.5M Nac1

c.中和度：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1

d.20×SSC：0.3M柠檬酸钠,3M Nac1

e.2×SSC：0.03M柠檬酸钠,0.3M Nac1

程序：

（1）将胶浸入0.25M HC1中10分钟。HC1处理的作用主要是通过去嘌呤使DNA分子断裂，因而有利于高分子量DNA的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于10kb的DNA片段时可省略此步骤。

（2）进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20-30分钟。

（3）把胶浸入变性液中，室温浸泡15分钟×2次。

（4）蒸馏水漂洗凝胶2次。

（5）把胶浸入中和液中，室温泡15分钟×2次。

（6）在处理凝胶的同时，切一张与胶同样大小的尼龙膜或硝酸纤维膜。硝酸纤维膜用2×SSC浸泡。

剪两张Whatman3#滤纸和一叠吸水用的粗滤纸注意不能用手指直接触及膜面。

（7）准备转移用平器和支架，平器中放20×SSC。架子上搭滤纸桥使溶液能够虹吸上来。

（8）依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水滤纸，玻璃板，适量重物(500-1000g)

注意：要检查PH值，用硝纤膜时PH<9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部“绝缘”，气泡处的DNA难以被吸到硝酸纤维膜上。

（9）于室温转移12-20小时。

（10）取出转移膜，用2×SSC漂洗数次，以去掉可能粘附于膜上的凝胶。

（11）固定：可选择下述方法之一进行DNA固定

·紫外线固定：使用长波紫外线照射10-20分钟，简单漂洗后干燥备用。

·尼龙膜置+120℃烘烤30分钟。

·硝纤膜置真空烤箱中，80℃减压烘烤2-2.5小时，以避免硝纤膜自熔。若无真空烤箱，

亦可在普通烤箱中65-70℃烘烤3-4小时，也能达到固定目的。?固定后，将膜封于塑料袋中，保存于干燥处待杂交。

注意事项?①转移液的盐浓度对转移具有一定影响。应选择20×SSC快。10×SSC转移速度较快，对于高分子量DNA(〉10Kb)效果比较理想。因此要根据不同目的选择适当的转移液。

②转移时不能移动上边重物，防止出现“重影”现象。

③硝酸纤维膜对于0.5kb以下的小分子DNA结合不牢，转移时容易丢掉。要探测小片时最好用尼龙膜。

2 .  Southern印迹杂交杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过预实验来选择合适的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择5-25ng/ml?，应通过模拟杂交实验来选择合适的探针浓度。

试剂

a.Standard buffer

b.Standard buffer+50% formamide

c.High SDS buffer

d.Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDS

e.Wash Solution Ⅱ:0.5XSSC,0.1%SDS

程序

①将转移好的尼龙膜或硝纤膜装入塑料袋中，每边各留2-4mm空隙。灌注杂交液的一边留1cm空隙。在角上剪开一个小口，灌注预杂交液，从切口处赶走气泡，用封膜机封口，浸入水浴中。

②根据所选择的不同预杂交液，采用不同的温度预杂交4-20小时：Standard buffer:预杂交温度65-68℃，Standard buffer+50% formamide:37-42℃，High SDS buffer:37-42℃。

③使用双链DNA探针时，沸水浴10分钟以变性探针。然后迅速插入冰中。

按模拟杂交实验所确定的探针浓度将适量探针加入到预杂交液中，配成杂交液，一般浓度5-25ng/ml?。按每100cm2膜加入至少3.5ml配制杂交液。

④使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16-20小时。

⑤杂交结束后，取出杂交袋，剪开一个小口，将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20℃以备下次使用。这样至少可保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃10分钟以变性探针。杂交液如含有50%甲酰胺，则在68℃变性10分钟即可。

⑥取出杂交膜，用Wash Solution I洗5分钟×3次。

⑦保温冲洗：用Wash SolutionⅡ于68℃冲洗15分钟×2次。

(六) DNA Dot Blotting

此检测方法用于快速定性筛选DNA。样品可以是纯化DNA，也可以是细胞碎片PCR扩增的DNA。预杂交和杂交方法与Southern基本一致，不同的仅是样品的处理不同。

试剂：DNA dilution buffer∶10mM Tris-HC1；1mM EDTA,PH8.0；50μg/ml herring  Sperm DNA

程序

①将样本DNA稀释成不同浓度。

②将样本DNA于+95℃水浴10分钟，迅速插入冰中。

③取1μl点样至尼龙膜或硝纤膜上。点样前先画上圆卷做记号。

④用紫外线照射固定或+120℃烘烤30分钟固定。

其后杂交步骤Southern相同

（七）DAB显色检测法

试剂：

a. .Biotin—Mouse  Anti—Digoxin                200μl

b. SABC—POD                                200μl

c. DAB Stock Solution                           5ml

d.冲洗液：0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1, PH7.4。

e.封闭液：1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1。

f.显色缓冲液：0.1M PBS,150mM Nacl,PH7.4。

g.TE缓冲液：10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0

程序：

1.         经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。

2.         用干净的杂交袋或平皿，封闭液室温封闭60分钟。

3.         用冲洗液冲洗5分钟×3次，每次100ml。

4.         用封闭液(e)1：1000-2000稀释Biotin—Mouse  Anti—Digoxin，例如10μl Biotin—Mouse  Anti—Digoxin加至10-20ml封闭液中(稀释液+4℃可稳定24小时左右)。将适量稀释抗体加入杂交袋中37℃反应1-2小时。

5.         用冲洗液冲洗5分钟×3次，每次100ml。

6.         用封闭液(e)1：1000-2000稀释SABC，例如10μl SABC加至10-20ml封闭液中(稀释液+4℃可稳定24小时左右)。将适量稀释SABC加入杂交袋中37℃反应1-2小时。

7.         用冲洗液冲洗15分钟×3次，每次100ml。

8.         按1：40配制底物显色液：250μl储备液加至10ml显色缓冲液中，用前加最终浓度为0.03

    %的H2O2，室温显色5—30分钟左右。?当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录。还有一种选择是让膜干燥保存。 (责任编辑：泉水)