八、光敏2，4-二硝基苯（光敏DNP）标记DNA法

　　光敏DNP由一连接臂组成，一端是2，4-二硝基苯，另一端有芳基叠氮化合物。此法适用于含氨基检测基团。其敏感性和光敏生物素标记探针相同，检测时需要抗DNP抗体和免疫化学显色。标记方法：（1）DNA不心变性，必须溶于水中，取2～10μg10μl，加入二甲亚砜25μl，每微克DNA加入光敏DNp 2μg（在避光条件下），混匀。（2）置入冰浴中，在特制灯10cm下照射10min。（3）加入水165μl，4mol/L醋酸钠20μl和异丙醇50μl，混匀。（4）用705和无水乙醇沉淀各一次，晾干，按50μg/ml溶于200μl水中，如探针不溶时，可在60℃水溶中加热10min，离心5min，除去不溶性杂质，分装，-20℃可保存1～2年。此法简便，不仅适用于核酸标记，也适用于蛋白质标记。

　　九、三硝基苯磺酸（TNBS）标记核酸探针

　　在温和的条件下，TNBS将核酸的胞嘧啶转化为N-甲氧基-5，6-二氢嘧啶-6-磺酸盐衍生物，对胞嘧啶残基进行磺化修饰制成磺化半抗原探针。此法十分简便，也可用于蛋白质的标记。标记方法：取变性单链的DNA5μg，溶于0.02mol/L硼酸钠缓冲液（pH8.6）中，加入TNBS5μg溶解，在室温中反应1h。移入冰浴中，加入无水乙醇和70%乙醇各洗1次，晾干，用50μl消毒双蒸水溶解，分装，-20℃保存备用。

　　十、生物素化的RNA探针标记

　　RNA探针比cDNA探针的敏感性提高10倍以上，在许多优点。它们是单链，不需变性，也没有互补链的干扰，与靶基因杂交比DNA探针更稳定。Bio-11-dUTP可通过Sp6、T3和T7RNA聚合酶掺入到RNA转录子中。标记方法：其下列反应体积为50μl：40mmol/l Tris HCl pH8.0、8mmol/l MgCl2、2mmol/L亚精胺、25mmol/l NaCl, 1mmol/L每一ATP、GTP、GTP，1mmol/L生物素Bio-11-Dutp,500ng模板，45u T3RNA聚合酶。混合，37℃反应1h。加入10%SDS终止反应。凝胶过滤分离标记RNA探针。

　　十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法

　　此法标记原理如下图所示：

　　标记的HRP部分催化底物化学发光反应：氨基苯二甲酰肼　氨基苯二甲酸

　　+N2+光→X-光片上感光10～20min显定影。

　　光亮子在酚、萘及胺类等增强剂促进下，而使光亮增强。

　　这种方法就是利用特殊的酶底物，氧化后把产生的能量转变为光能放出，称为化学发光。杂交后与探针结合的酶催化相应的发光剂，经增强剂将光能放大，在X光片上显示杂交信号。此方法灵敏度与同位素标记水平相当，简便快速，安全，是一种特异性好的检测手段，具有广泛的应用前景。

　　HBV-DNA的HRP标记方法：质粒中插入HBV全基因组DNA，长3.2kb，载体为PBR322质粒，4.3kb。将质粒DNA用三蒸水稀释成10ng/μl，取20μl放入EP管，100℃变性5min，加入20u HRP标记试剂，混匀，加入戊二醛20μl混匀，37℃10min，此时可立即使用，或放在冰浴中10～15min内使用，或加入50%去离子甘油-20℃保存供分子杂交用，可存放6个月。

　　十二、用聚合酶链反应标记高活性DNA探针

　　聚合酶链反应（PCR）或称体外基因倍增技术，它利用一对位于待扩增的DNA序列两端的取向相对的DNA引物，在DNA聚合酶的介导下，经过多次变性，退火和延伸过程的重复性循环，大量合成靶DNA序列。在标记dNTP存在时，经PCR反应产生的靶DNA片段均参入了标记物，用此法标记的探针标记率高达97.4%。此法重复性好，简便、快速、特异、不要求模板DNA的纯度，可以大量制备。此法有普遍应用价值。

　　标记方法如下：待标DNA模板1ng,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),2.5mmol/L MgCl2 dATP、dCTP、dGTP各200μmol/l dTTP150μmol/Ll,Bio-11-dUTP 50μmol./L, 引物各1μmol/L，明胶200μg/ml，2u Taq DAN聚合酶，总反应体积为100μl。混匀后，加石蜡油封顶，94℃和55℃各2min，72℃3min，经25个循环后，可产生5～10μg标记探针，需时仅4h。乙醇沉淀扩增的产物后，溶于100μl TE中，分装-20℃。

上一页  [1] [2] [3]