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【求助】探针制备

时间:2010-09-13 03:47来源: 作者: 阅读:
有人自己做过探针吗?试剂盒太贵了,不太实用,想自己做,不知效果会怎样。希望做过的人给点指点。万分感激!我目前自己在做探针。比较的艰苦。

不知道你要做什么样的探针?长片断的? 还是寡核苷酸探针?如果寡核苷酸的,直接公司合成更合适一些。

另外,你的探针准备标记什么?生物素?地高辛?还是荧光?
DNA的还是RNA的?用于原位杂交还是其他?这是我合成荧光原位杂交探针时用到的一些方法,希望有用。

 一、特异性目的核酸(或基因)的制备
  核酸分子探针的制备首先需要获得所要的特异性核酸或其片段。可用以下方法制备:
  (1)直接分离基因核酸:即从基因组上直接用内切酶切下所需基因。
  (2)化学合成基因核酸:即以单核苷酸为原料,以固相磷酸三酯法合成某一结构完全清楚,分子量较小的寡核苷核。
  (3)酶促合成核酸:在真核细胞中获得特异的结构基因。常用方法是以mRNA为模板,利用逆转录酶合成单链cDNA,再以大肠杆菌DNA聚合酶I合成双链的结构基因。
  (4)RNA探针。
  二、目的核酸的扩增
  在获得特异的目的基因后,可用以下方法大量扩增制备:①用体外DNA重组技术与载体DNA相连,转化至大肠杆菌中进行无性繁殖。以氯化铯超速离心纯化重组质粒DNA,并以合适限制性内切酶消化,经凝胶电泳制备回收特异的目的核酸片段。②聚合酶链式反应(Poly-merase chain reaction, PCR)扩增技术:利用这种先进技术能简便快速制备大量特异性目的核酸片段。PCR技术的基本原理是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特征,在体外用一对和欲扩增DNA片段的两侧序列互补的引物诱发聚合反应,即双链DNA先高温变性,然后在低温下与引物退火,再在中等温度进行链延伸反应。上述在三种不同温度下的变性、退火和延伸为一个循环反应,重复这种循环反应可使DNA获得指数性倍增,例如经过35个循环反应,DNA可扩增1×108倍以上。
三 标记核酸探针
(一)缺口平移法
  在适当的浓度的DNase I作用下在一双链DNA上制造一些缺口,再利用大肠杆菌DNA聚合酶I 的5’—3’外切酶活性依次切除缺口下游的核酸序列,同时将四种脱氧三磷酸核苷(其中一种用所需标记物标记)利用该酶5’—3’聚合活性补人缺口,使缺口逐个平称并在平移过程中形成标记的新生核酸链。 (二)末端标记法
  在大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激酶(T4PNK)的催化下,将标记-ATP上的磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。要求标记的寡核苷酸5’端必须带羟基。
(三)聚合酶链反应(PCR)标记
用标记的dUTP替代dTTP。(责任编辑:glia)
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