【求助】探针制备

有人自己做过探针吗？试剂盒太贵了，不太实用，想自己做，不知效果会怎样。希望做过的人给点指点。万分感激！我目前自己在做探针。比较的艰苦。

不知道你要做什么样的探针？长片断的？还是寡核苷酸探针？如果寡核苷酸的，直接公司合成更合适一些。

另外，你的探针准备标记什么？生物素？地高辛？还是荧光？
DNA的还是RNA的？用于原位杂交还是其他？这是我合成荧光原位杂交探针时用到的一些方法，希望有用。

　一、特异性目的核酸（或基因）的制备
　　核酸分子探针的制备首先需要获得所要的特异性核酸或其片段。可用以下方法制备：
　　（1）直接分离基因核酸：即从基因组上直接用内切酶切下所需基因。
　　（2）化学合成基因核酸：即以单核苷酸为原料，以固相磷酸三酯法合成某一结构完全清楚，分子量较小的寡核苷核。
　　（3）酶促合成核酸：在真核细胞中获得特异的结构基因。常用方法是以mRNA为模板，利用逆转录酶合成单链cDNA，再以大肠杆菌DNA聚合酶I合成双链的结构基因。
　　（4）RNA探针。
　　二、目的核酸的扩增
　　在获得特异的目的基因后，可用以下方法大量扩增制备：①用体外DNA重组技术与载体DNA相连，转化至大肠杆菌中进行无性繁殖。以氯化铯超速离心纯化重组质粒DNA，并以合适限制性内切酶消化，经凝胶电泳制备回收特异的目的核酸片段。②聚合酶链式反应（Poly－merase chain reaction, PCR）扩增技术：利用这种先进技术能简便快速制备大量特异性目的核酸片段。PCR技术的基本原理是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特征，在体外用一对和欲扩增DNA片段的两侧序列互补的引物诱发聚合反应，即双链DNA先高温变性，然后在低温下与引物退火，再在中等温度进行链延伸反应。上述在三种不同温度下的变性、退火和延伸为一个循环反应，重复这种循环反应可使DNA获得指数性倍增，例如经过35个循环反应，DNA可扩增1×108倍以上。
三标记核酸探针
（一）缺口平移法
　　在适当的浓度的DNase I作用下在一双链DNA上制造一些缺口，再利用大肠杆菌DNA聚合酶I 的5’—3’外切酶活性依次切除缺口下游的核酸序列，同时将四种脱氧三磷酸核苷（其中一种用所需标记物标记）利用该酶5’—3’聚合活性补人缺口，使缺口逐个平称并在平移过程中形成标记的新生核酸链。　（二）末端标记法
　　在大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激酶（T4PNK）的催化下，将标记-ATP上的磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。要求标记的寡核苷酸5’端必须带羟基。
（三）聚合酶链反应（PCR）标记
用标记的dUTP替代dTTP。 (责任编辑：glia)

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