荧光原位杂交FISH的原理
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

• 荧光原位杂交操作规程
• 仪器设备
      1、 医用微波炉；
       2、 水浴锅；
       3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜；
       4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。
  
  FISH试剂
      （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；
       （2）20×SSC（pH7.0）；
       （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；
       （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
       （5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。
       （6）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。
  
  实验步骤
      1、脱蜡：
       1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；
       2）100％酒精两次，每次2min；
       3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
      2、蛋白酶处理:
       1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
       2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
       3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
       4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
      3、变性：
       1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；
       2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
       3）78℃孵育8min；
       4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；
       5）空气干燥。
      4、杂交：
       1）准备探针；
       2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；
       3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；
       4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
       杂交后的水洗：
       5）镊子小心去除盖玻片；
       6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
       7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；
       8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
       检测：
       9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
       10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；
       11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。
  扩增：
       12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
       13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
       14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；
       15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
       16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
       17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。
      5、细胞核染色：
       1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
       2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。