MM2　　 甲酰胺　　　　　　　5.5ml

　　硫酸葡聚糖1　　　.0gm

　　20×SSC　　　　　0.5ml

　　首先将溶液在70℃加温，以溶解硫酸葡聚糖，冷却后调整pH至7.0,容量加至70ml。这容量是最后应用的杂交混合液的70%，其余的30%为核酸探针和水（如果需要的话）。MM1给预杂交混合液是：50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖2×SSC。Trask发现MM2效果较MM1好，DNA的Tm比MM1低-8℃。在2×2cm区域杂交混合液应为：MM17μl，DNA探针（保存液为500μg～10mg/ml）1μl，加探针混合液2μl，总量为10μl。

　　（6）杂交：每张盖玻片加10μl杂交混合液，注意移除气泡，可在盖片四周加橡皮泥封固，在37℃湿盒中过夜。

　　（7）漂洗：从温箱中取出后，以镊子移除橡皮泥，从现在起注意勿使载片干燥。否则盐的晶体将产生非特异性背景染色，漂洗应用2×SSC（pH7）在45℃3min×3。不时震动以助彻底漂洗，盖玻片将在漂洗中自然移除。然后再在2×SSC，45℃，2min×3。保存载片于PBS溶液内。

　　（8）荧光显示：

　　①生物素标记DNA探针的荧光显示。

　　1）应用PBS含5%无脂干奶（5μl每张盖片），也可用1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS覆盖孵育5min室温，以封闭非特异性结合部位。

　　2）移除多余液体，加抗生素-FITC（5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA，5μl/cm2）。在湿盒中，室温孵育20min。抗生物素-FITC在此应用是过量的，因此，可回收贮存4℃再次应用，其保存时间可达数周。反应见图20-4A直接法。

　　3）漂洗：PBs 2min×3，45℃。

　　4）如需放大（amplification）,即提高其敏感度，可按图20-4B间接法加生物素化羊抗抗生物素抗血清（biotinylated goat – antivaidin antibody）30min室温。倾去加另一层抗生物素-FITC抗血清孵育20min，重复上述1）～3）。

　　②AAF标记核酸探针的荧光显示

　　2）倾去多余液体，加抗-AAF抗血清1：750，PBS-Tween –NGS溶液（如上i）5μl/cm2盖玻片。室温37℃。孵育30min.

　　3）漂洗：PBS-0.1%Tween室温5min×3，间歇性振荡。

　　4）羊抗小鼠IgG-FITC孵育，1：300～1：1000在PBS-0.1%Tween含2%NGS，37℃孵育30min，如3）应用PBS-0.1%Tween 漂洗5min×3。

　　4．荧光标记DNA探针在细胞核混悬液杂交中的应用

　　（1）细胞核的分离：将培养的细胞制成细胞混悬液，或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用MgSO4染色分离方法分离细胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章　）。细胞混悬液浓度为5×106/ml。利用RNA酶消化后，使核从细胞分离，细胞核混悬液浓度为4～5×106细胞核/ml。

　　（2）细胞固定和酸的处理：在5ml试管内加冷的100%酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留10min。在4℃离心（×150g）10min。重复加三次冷的100%酒精入试管内，离心，倾去。置于冰上10min，再离心。然后加入相当核悬液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室温停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO4, 5mmol/L HEPES pH8.0）。再离心，重复IBM漂洗（这时细胞核可在不染色情况下，以荧光显微镜观察）后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，继之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO4。在室温静置站立10min。倾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，离心，使细胞核混悬液最终浓度为108/ml，（可用IBM-Triton X-100稀释约50倍，在血球计数器计数），混悬液镜检应含单个，完整的细胞核。

　　（3）细胞核混悬液杂交

　　①配制杂交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH调至7.0。此原液（stock solution）可贮存在4℃冰箱内。应用时加1份10mg/ml鲱鱼精子DNA（herring sperm DNA）。

　　②混合1μl的细胞核混悬液（108/ml）与18μl的杂交混合液，充分混匀。将此19μl混合液移入1.5ml容积的Eppendorf 管中（核含量约为105）。

　　③加入100ng/每管的AAF标记DNA探针（如为生物素标记DNA探针浓度为20～40ng/每管）。

　　④置70℃10min使DNA探针和核DNA变性。

　　⑤和组织切片与DNA探针杂交方法相较，不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应，而应迅速转入37℃孵育过夜。

　　（4）杂交后漂洗

　　①在每管中加入1.25ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0），在42℃静置10～15min。偶尔旋转以助混匀。冷却至室温。加100μl经dimethylsuberimidate(DEMS)处理的血细胞（107/ml）混匀，离心，室温，10min，轻弹试管使沉淀的小块散开，加入1.25ml 2×SSC(pH7.0)，42℃，继之，静置于室温10～15min，如前离心，再加1.25ml IBM-Triton X-100,室温静置5min，离心。

　　注：DEMS处理红细胞方法：经漂洗并离心去除白细胞和血清的红细胞在盐液如PBS中，细胞含量为108/ml，以K2CO3和DEMS溶液处理3次，第1次：K2CO3为20mmol/L,DEMS为3mmol/L，以后2次：K2CO3依然为20mmol/L，而DEMS为10mmol/L。在应用前将K2CO3和DEMS液混合加入红细胞混悬液中。在最后2次漂洗液中，应用100mmol/l K2CO3将pH调至9～10。在25℃，15min后，加入50μl，100mmol/l 的柠檬酸（citric acid）/每ml细胞混悬液的浓度以达固定红细胞的目的。固定的红细胞离心倾去上清液后，用2×SSC稀释到108/ml，加0.1%叠氮钠可在4℃保存至少1年。

　　（5）AFF标记的荧光显示：加200μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS），轻轻振荡混匀，室温静置10min，加20μl 1：100的单克隆抗AFF抗体，37℃孵育45min，加1.25ml的PBS-Tween，室温静置10min，加20间歇性振荡，离心，倾去上清液，加200μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振荡，室温静置10min，加20μl的羊抗小鼠–FITC荧光标记抗血清，稀释度1：100～1：300。孵育于37℃45min，加1.25ml PBS –Tween,室温静置10min，离心，倾去上清液。

　　（6）生物素标记探针的荧光显示：加200μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室温静置10min后，加20μl抗生物素标记FITC抗血清15μg/ml，孵育在37℃30min，以1.5ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25ml IBm –Triton X-100,室温静置10～15min，间歇振荡、离心。

　　（7）荧光显微镜观察：将细胞核混悬液稀释于250μl的IBM-Trion X-100中，轻加振荡混匀。为抗荧光褪色可加等量的抗褪色溶液至载片上的细胞核涂片上，选择适当的激发波长观察。

　　（8）流式细胞计：将750μl的细胞核混悬液通过流式细胞仪（Flow cytometry, FCM），DEMS处理过的红细胞作为对照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT）。详细操作见第十章　。

　　二、寡核苷酸探针的应用

　　寡核苷酸探针的优点在于它能根据需要人工用DNA合成仪合成，其长度及分子大小比较一致，可以控制。其长度一般较克隆的DNA片段短。目前，寡核苷酸探针已能成功的为放射性同位素、荧光素、生物素和地高辛所标记，并成功地运用于培养细胞、组织切片和染色体铺片等的原位杂交中。虽然有些科技工作者认为其敏感度不如来自质粒扩增的cRNA或DNA探针，但由于探针制备简便再加之于近年非放射性标记的成功，寡核苷酸探针在生物基础医学及临床学科领域中得到较为广泛的应用。

　　在原位杂交组织化学中应用寡核苷酸探针，其基本操作要点是相同的，如杂交温度在Tm -25℃，杂交孵育时间以过夜（16h左右）为佳。应用寡核苷酸探针在原位杂交组织化学技术中的成功与否主要决定于探针的设计，使有效配

上一页  [1] [2] [3] 下一页