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RNA原位杂交现状和进展

时间:2010-09-19 15:16来源: 作者: 点击: 130次

  原位杂交技术能在目的细胞和组织中观察基因和分析基因的缺失,增减和变异,使传统的基础医学和临床医学研究推进到基因分子认识水平.尤其是RNA原位杂交已成为最有效的分子工具.从培养细胞检测结果表明,采用荧光素标记探针结合CCD摄录的图象分析处理系统,原位杂交的分辩率已达到1kb靶DNA的灵敏度.而在冰冻和石蜡切片中原位杂交的灵敏度远不如培养细胞,靶DNA仅为40kb,而mRNA为10-20拷贝.如何提高组织切片中杂交信号的敏感度已成为当今原位杂交技术研究的热点,采用寡核苷酸与多种cRNA探针似鸡尾酒混合方式,以同一序列合成不同探针来提高杂交的灵敏度.其次为组织前处理的改进,RNA原位杂交和免疫组化并检技术和激光共聚焦显微在多重RNA原位杂交中应用等.

  (一) 组织前处理的改进

  RNA原位杂交中组织固定多推荐 4% 多聚甲醛,固定时间不超过24小时,尤以冰冻切片为佳.1998年Liu[8]比较了同一肾组织和肺组织,用4% 多聚甲醛和10% 中性福尔马林固定,石蜡切片和冰冻切片中RNA原位杂交检测结果.按0.5,4,16和48小时时间段检出杂交信号,经图象分析系统处理并比较阳性率,阳性强度和杂交信号定位等表明:(1)固定36,48小时时间段,石蜡切片组结果好于冰冻切片组;(2)中性福尔马林固定与多聚甲醛无明显差异.同样的结果还见于Le[9] 在甲状腺组织肿瘤的研究.这些报道为外检病理标本作回顾性RNA原位杂交开辟广阔应用前景.

  (二) 杂交信号放大

  通过原位PCR方法来扩增靶RNA核苷酸片段来提高原位杂交的

  敏感性,从理论上讲也是成立的.但从近几年应用结果表明主要存在以下问题:(1)如何避

  免扩增后核苷酸向细胞外弥散,引起杂交信号的定位错误.(2)扩增后核苷核又如何得到有

  效标记,尤其是低敏感度扩增产物的标记.(3)如何预防凋亡细胞和RNA酶处理后切片中核碎

  片即非目的核苷酸片段扩增.(4)如何保持细胞形态和组织结构的完整性.(5)如何克服在应

  用微波和热处理中使9号染色体着丝点破坏所造成的假阳性.总之通过原位PCR,微波和热处理方法来提高靶细胞核酸数量或增加敏感性在应用中尚存在着异议[11-12].

  TSA是酪胺酰胺信号放大(Tyramide Signal Amplification)的缩写,而CARD则是催化报道基因*沉淀(Catalyzed reporter deposition CARD)的缩写(*报道基因:处于另一基因下游并

  可反映转录上游基因表达水平的基因).前者名称侧重酪胺酰胺的放大作用命名[10-11].19

  89年Bvbrow首先将TSA应用到斑点杂交和ELISA中来提高检出信号的敏感度.1995年由Kerstens[15] 和1997年Speel[13,18]等又将TSA引用到原位杂交中,因为检测低拷贝的RNA往往得不到有效的杂交信号,而TSA则使原位杂交的灵敏度提高了2-100倍,能在组织切片中检出多拷贝和单拷贝1-5kb的DNA 序列为低丰度的mRNA 和rRNA检测奠定了基础.从而在近两年内使RNA原位杂交技术得到稳步发展并展示广阔的应用前景. 1997年Schmidt[16]首先提出了CARD的命名,1999年 Yang[11]和Speel[13]综述了CARD在原位杂交中的应用.对酪胺酰胺的放大的原理和应用作了详尽描述:(1)低浓度的酪胺酰胺在辣根过氧化物酶活性和H2O2的作用下,通过催化报道基因使酪胺酶分布在原位杂交点或杂交点附近,使大量半抗原分子(生物素,地高辛,二硝基苯(dinitrophenyl)和荧光素介入而达到杂交信号放大.(2)而高浓度的酪胺酰胺在辣根过氧化物酶活性和H2O2的作用下催化报道基因直接发生沉积,使显色的面积增大而达到信号放大.(3)半抗原标记的探针与靶核苷酸杂交与抗半抗原抗体结合的辣根过氧化物酶 (HRP)反应又与荧光素标记的酪胺酶结合在荧光显微镜直接显示.(4)生物素标记或半抗原标记的酪胺酰胺通过链菌抗生物素,卵白素等通过间接放大显示[15].

  TSA或CARD是一种容易,快速,高度敏感和有效的提高杂交信号放大系统[10-18].尤其是不需要改变原有杂交实验流程,在杂交后加入或与荧光素,链菌素抗生物素相连接,以DAB等为底物,避免了 NBT/BCIP 在二甲苯中透明引起信号褪色,因此为技术人员所接受,而高敏感度和良好的定位更为病理学家所接受,而且为常规福尔马林固定的标本中开展以诊断为目的的杂交检测创造了条件,也为杂交信号计算机图象自动化处理应用开拓了应用前景.但应用TSA或CARD时应遵循以下几点:(1)按探针种类和不同组织类型在参考有关文献后作出.a.在探针杂交后应用,参考TSA试剂盒稀释浓度,在37℃ 或常温下孵育 5-15min,预处理中需抑制内源性过氧化物;b.酪胺酰胺结合荧光素可作直接显示;c.酪胺酰胺结合生物素,地高辛,荧光素,链菌素抗生物素,卵白素作间接显示其放大效果高于直接显示.(2)最佳信/噪比(Signo-to-noise ratio)和获得最大放大效果,在标准化原位杂交流程下进行,应适当调整探针浓度和免疫组化流程.(3)为获得最大限度信号放大,多采用间接显示法.通过链菌素抗生物素,酶和卵白素等增加杂交信号检出.(4)可采用葡聚糖或高分子量聚乙烯醇[24](

  Polyvinyl alcohol)增加酪胺酰胺定位和加速显色反应.(5)杂交后固定应省略,越来越多

  研究表明,杂交后固定可导致杂交信号减弱.总之TSA或 CARD不但能促使原位杂交技术的发展,尤其是在RNA原位杂交中显示无与论比的应用前景.

  (三) RNA原位杂交与免疫组化双重检测技术

  Fransje[19]报道了在正常表皮,剥落上皮和牛皮癣上皮的组织切片中先后作RNA原位杂

  交检测其组蛋白表达,同时用MIB作免疫组化标记检测细胞增值率,以阐述各组表皮的组蛋

  白表达与细胞动力学的关系.这种检测的设计非常完美,但检测技术较为繁杂.因为一般抗

  血清中含有较多的RNA酶,若先进行免疫组化,需加入核酸酶抑制剂,先进行原位杂交,杂交

  液中不宜含聚蔗糖,否则会增强免疫组化的染色背景.杂交前的预处理和杂交后的洗脱不宜

  过度,以免抗原变性或丢失.RNA原位杂交与免疫组化并检,一般先作原位杂交检测,后作

  免疫组化检测[19-22].

  (四) 多重RNA原位杂交技术

  Grino[23]运用激光共聚焦显微镜,成功地将标以同位素[s35]-UTP,地辛高-UTP和生物素-UTP三种cRNA探针,在下丘脑旁室核单个神经原细胞中检出促肾上腺皮质激素释放因子(Corlicotropin releasing factor),精氨酸后叶加压素(Arginine vasopressin)和Peptidylycin, α-amidating monooxygenase mRNA.在一张组织切片中进行多种RNA杂交的目的是研究某个细胞与相关细胞内基因表达水平,以及它们之间相互联系,有重要应用价值.切片在10μm以上,在组织前处理,预杂交以后,可将几种杂交探针同时加入进行杂交,然后按各种标记的要求作免疫反应,并以不同方法依次显色,是难度极高的RNA原位杂交.

(责任编辑:glia)
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