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核酸的分子杂交技术及其应用

时间:2010-09-21 17:02来源: 作者: 阅读:

1 概 述

核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一,是定性或定量检测特异RNA 或DNA 序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下,双链DNA 之间的氢键被破坏(变性),双链解开成两条单链。这时加入异源的DNA 或RNA (单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性),若异源DNA 或RNA 之间的某些区域有互补的碱基序列,则在复性时可形成杂交的核酸分子。

在进行分子杂交技术时,要用一种预先分离纯化的已知RNA 或DNA 序列片段去检测未知的核酸样品。作为检测工具用的已知RNA 或DNA 序列片段称为杂交探针(probe)。它常常用放射性同位素来标记。

虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史,但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献,在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。而且,随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展,使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。

2 核酸探针的制备

 核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。比活度高就可提高反应的灵敏性,减少待测样品的用量。目前一般所用的是体外标记,这里介绍几种最常用的方法:

2.1 DNA 的切口平移

 双链DNA 分子的一条链有切口时,大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端,同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性,它还可从5’端除去核苷酸。这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行,导致切口沿着DNA 链移动,称切口平移(nicktranslation)。常用于在双链DNA 上打开切口的酶为胰DNA 酶Ⅰ。由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸,就有可能制备比活度大于108 计数/(分.μg)的32 P标记的DNA 探针。

2.2 单链DNA 探针的制备

 与传统的双链探针相比,单链探针由于不存在互补链,因此可以消除由探针的两条链重退火形成无效杂交体的可能。最常用的是以M13噬菌体载体合成单链DNA 探针的方法。其主要原理是用人工合成的寡核苷酸引物(其序列与载体上固定区段的序列相互补。可从生物试剂公司直接购买)与来自重组M13噬菌体的单链DNA 退火,然后以此寡核苷酸作为引物在大肠杆菌DNA 聚合酶ⅠKlenow大片段催化下合成互补的放射性标记DNA 。

2.3 单链RNA 探针的制备

 首先将感兴趣的DNA 序列到带有SP6噬菌体或T7及T3噬菌体的启动子的重组载体质粒中。由于这些重组质粒带有的强启动子能被噬菌体的依赖DNA 的RNA 聚合酶所识别。因此,当把线状质粒与适当的依赖DNA 的RNA 聚合酶及4种rNTP(核糖核苷三磷酸)在体外混合并温育时,就可在噬菌体启动子处开始合成RNA 。

单链RNA 探针除具有单链DNA 探针的优点之外,还具有:①合成效果高(模板可反复被转录);②用DNA 酶Ⅰ处理就可容易除去RNA 探针中的模板DNA ,而无需用凝胶电泳纯化;③RNA 杂交体稳定性高,所以探针在杂交反应中产生的信号较DNA 探针强,等优点。

3 杂交膜的准备

 核酸的分子杂交可分成液相杂交和固相杂交两大类。液相杂交是将待检测的核酸样品和同位素标记的杂交探针同时溶于杂交液中进行反应,然后分离杂交双链和未参加反应的探针,用仪器计数并通过计数分析杂交结果。固相杂交是把欲检测的核酸样品先结合到某种固相支持物上,再与溶解于溶液中的杂交探针进行反应,杂交结果可用仪器进行检测,但大多数情况下直接进行放射自显影,然后根据自显影图谱分析杂交结果。目前,固相杂交技术的发展较快,而且应用范围更为广泛。

目前使用最多的固相支持物是硝酸纤维素(NC)膜。它对单链DNA 有较强的吸附作用。RNA 经过一些特殊变性剂处理后,也能较容易地结合到NC膜上。下面介绍固相杂交反应中常用的几种将核酸样品转移到膜上的方法。

3.1 点印迹的直接点样法(Dot blotting)

 这是一种能快速而且简便地检测样品中微量核酸的常用技术。其方法主要是将待测样品直接在NC膜上,然后进行杂交检测。其主要过程包括膜的处理、点样、变性、中和、干燥固定以及变性剂去除(检测RNA 法)等。

3.2 DNA 转移(Southern blotting)

 用于点印迹的DNA 直接点样法具简单、快速、灵敏度高等优点,但不能确定特异DNA 序列的大小和定位。1975年Southern氏建立了吸附转移法硝酸纤维素膜杂交。其主要原理是利用滤纸对水的毛细管吸附作用,将经限制酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离的的DNA 片段转移到固相杂交膜上,此时的DNA 片段还保留着原来凝胶中的分布图式。然后再用探针进行杂交。

3.3 RNA 转移(Northern blotting)

 这是在Southern blot的基础上发展的RNA 固相杂交技术,其因两技术相类似而得名。其方法与Southernblot一样。但RNA 需先经乙二醛等变性剂处理后,再于合适的条件下电泳,这样便能使充分变性的RNA 像变性DNA 一样直接转移到NC膜上。固定之后除去变性剂,再进行杂交,可大大提高杂交的敏感性,每条区带所需的RNA 量可从500pg降低到1pg以下。

此外,由于有时需要分离的核酸样品分子量很小,用琼脂糖凝胶不能达到要求的分辨率。这种情况下往往需要聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行分离,而由于这种胶的孔经较小,用前述的吸印转移法转移速度缓慢,易造成转移不完全。为了解决之一问题,发展了电泳转移法。即以电泳的方法使分离后的待测核酸样品从凝胶转移到NC膜或DBM纸等固相支持物上,再进行杂交。

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  • (责任编辑:glia)
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