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核酸探针杂交实验

时间:2010-09-21 17:02来源: 作者: 阅读:

以放射性标记探针与固定在NC膜上的核酸进行杂交为例,杂交反应操作如下:
① 配制所需试剂
  SSC溶液(20×):3mol/L NaCl,0.3mol/L柠檬酸钠。
  Denhardt's溶液(50×):聚蔗糖5g,聚乙烯吡咯烷酮5g,牛血清白蛋白(BSA)5g加水至500ml。
  预杂交液:6×SSC,5×Denhardt’s溶液,0.5%SDS,100?g/ml经变性或断裂成片段的鲑精DNA。
② 将含靶核酸的NC膜漂浮于6×SSC液面,使其由下至上完全湿润,并继续浸泡2分钟。
③ 将湿润NC膜装入塑料袋中,按0.2ml/cm2的量加入预杂交液,尽可能挤出气泡,将袋封口,置68℃水浴1-2小时或过夜。
④ 将双链探针做变性处理使成单链,即于100℃加热5分钟,然后立即置冰浴使骤冷。
⑤ 从水浴中取出杂交袋,剪去一角,将单链探针加入,尽可能将袋内空气挤出去,重新封口,并将杂交袋装入另一个干净的袋内,封闭,以防放射性污染。
⑥ 将杂交袋浸入68℃水浴,温育8-16小时。
⑦ 取出杂交袋,剪开,取出滤膜迅速浸泡于大量2×SSC和0.5%SDS中,室温振荡5分钟,勿使滤膜干燥。
⑧ 将NC膜移入盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中,室温漂洗15分钟。
⑨ 将NC膜移入一盛有大量0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中,37℃漂洗30分钟至1小时。
⑩ 将NC膜移入一盛有新配0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中,68℃漂洗30分钟至1小时。

取出滤膜,用0.1×SSC室温稍稍漂洗,然后置滤纸上吸去大部分液体,待做杂交信号的检测。

(责任编辑:glia)
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