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原位杂交实验步骤

时间:2010-09-25 22:49来源: 作者: 阅读:
原位杂交实验步骤 点击次数:84 发布时间:2010-4-28 17:14:42

一质粒制备
1质粒的转化和扩增
1.1制备XL1-Blue感受态细菌
1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中,37℃、100rpm培养4h,离心,倒置,以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌,冰浴30min,离心,弃上清,倒置,再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌,分装(200μ/tube),-80℃保存。
2.转化:在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻,将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3.轻轻摇匀,冰浴30min。
4.42℃热激9O秒,然后迅速冰浴2min。
5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml,在37℃,100转/min水浴孵育60min。
6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基),待菌液全部被吸收后,倒置平板于37℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落
1.用无菌牙签挑取单菌落,接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中,于37℃,200转/分培养2h,取1ml之一Eppendorf离心管,加50μl10mmol/LEDTA(pH8.0)。
2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后,振荡30秒。
3.在70℃温育5min,然后冷却到室温。
4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液,振荡3O秒后,冰浴5min。
5.12000g,4℃离以3min,以除去细菌碎片。
6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml),取50μl上清液加入到样品孔中,其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V,进行电泳。
7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时,停止电泳,在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。
1.3质粒的扩增和纯化
1.用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30mlLB-氨苄青霉素(50μg/ml)培养液的聚丙烯管中,于37℃,200转/分培养3h。
2.将菌液转入含70mlLB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中,37℃,200转/分培养过夜(12-16h),细菌浑浊。
3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇,100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液,终浓度为170μ/ml)。37℃,200转/分培养12-16h。
4.将培养的细菌倒入50ml的离心管中,6000rpm,4℃离,th,15min,沉淀细菌。
5.弃净上清夜,用2ml预冷的溶液I,悬浮菌体沉淀,剧烈振荡,于室温静置5min
6.加入新配制的溶液II4ml,快速用手晃动10秒,颠倒数次后,于室温静置10min。
7.加入预冷的溶液III3ml,温和振荡l0秒,于冰上静置10min,出现白色絮状沉淀。
8.6000rpm,4℃离心15min,保留上清。
9.将上清(若带细菌残片,则再次离心)移入另一50ml的离心管中,加入0.6倍体积的异丙醇混匀,于室温静置10min。(或-20℃4h,或4℃过夜,可便核酸沉淀)
10.12000rpm,4℃离心15min,回收核酸。小心弃去上清,倒置离心管使残兼上清液流尽。
11.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁,室温12000rpm离心,15min,充分弃去乙醇,于室温将离心管倒置在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
12.用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀,转移至1.5mlEppendorf管中。
13.加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液600μl,充分混匀。12000rpm,4℃离心15min,以沉淀高分子量的RNA。
14.将上清转移到另一1.5mlEppendorf管中,加等量异丙醇,充分混匀,于室温静置10min。
15.12000rpm,4℃离心15min,回收核酸。小心弃去上清,倒置离心管使残余上清液流尽。
16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁,室温12000rpm离心,15min,充分弃去乙醇,于室温将离心管倒置在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转移到另-1.5mlEppendorf管中,室温放置1.5mlEppendorf管中30min。
18.加入400μl13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L),混匀,4℃12000rpm离心5min以回收质粒DNA,弃去上清。
19.加入400μlTE缓冲液(pH8.O)溶解沉淀,再分别用等体积的Tris饱和酚、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、和氯仿各抽提一次。
20.将水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中,加入O.1体积(约50μ13M的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积(大约1ml)的无水乙醇,充分混匀后于4℃放置30min。
21.于4℃12000rpm离心5min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清,敞开管口,置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。
22.加入400μl处于4℃的70%乙醇,稍加振荡,漂洗沉淀,4℃12000rpm离心2min。
23.吸去上清,室温敞开管口,直到乙醇完全挥发。
24.用100μlTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀。
25.取4μl溶液1:100稀释后,测定其OD260、OD280,以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260/OD280>1.8。OD260/OD280对DNA而言其值大约为
1.8,高于2.0则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染。;DNA浓度=OD260X0.05X稀释倍数(μg/μl)。
26.质粒DNA溶液于-20℃保存待用。
二、cRNA探针的标记
1.将质粒DNA,用相应的限制性内切酶线性化,通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。
2.线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化,作为cRNA探针标记的模板,用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。
3.进行体外转录,步骤如下:
4.在冰上将各试剂加入一1.5ml无RNA酶的Eppendorf管中。DEPC处理的三蒸水8μl
质粒DNA模板0.05μg/μl 1μl
10xNTP地高辛标记混合物 1x 2μl
0.1MDTT溶液 10mM 2μl
5x转录缓冲液1x 4μl
RNAse抑制剂 2U/μl1μl
RNA聚合酶 2U/μl 2μl
反应体系总体积 20μl
5.加入上述各试剂后,混匀,简短离心后在37℃孵育2h。
6.加入2μl无RNA酶的DNA酶I(10U/μ1),37℃孵育15min降解模板DNA。
7.加入0.2MEDTA(pH8.0)溶液2μl终止反应。
8.加入2.5μl的4MLicl和7.5μl冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置2h。
9.12000g下离以15min,弃上清,小心地用50μl冷的70%乙醇洗涤沉淀。
10.室温下稍干燥,溶于100μ1DEPC处理过的三蒸水中,混匀分装,-20℃下保持备用。
三、原位杂交
3.1冰冻切片与杂交前预处理
1.将子宫样品从-80℃取出,用OCT包埋,在-23℃(切片机腔体温度)平衡至少30min。将包埋好的样品固定在样品头上,切10μm厚的连续组织切片,平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片预先经180℃干烤6小时),保存于-70℃冰柜备用。
2.冰冻切片经室温干燥10min后,在4%的多聚甲醛-PBS(pH7.4)固定l0min。
3.活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次,每次5min。
4.在0.2M的盐酸作用中作用10min后,重复步骤4)。
5.在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1),37℃孵育15min,重复步骤4)。
6.经0.1MTEA(三乙醇胺)作用5min后,再在新配制的0.25%AA/0.1MTEA(乙酸酐/三乙醇胺,pH8.0)中乙酰化10min。(在大多数实验中,步骤4,5,6省略)
7.5xSSC中平衡15min。
3.2杂交
8.在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100μl/玻片),置于放有湿盒液(50%甲酰胺v/v;0.3MNaCl;1MmEDTA;10mMTris-Cl,pH8.O)的湿盒中,55~58℃下的烘箱中预杂交2h。
9.甩掉预杂交液,地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng/μl)经70℃变性1O分钟,置冰上1min,玻片上滴加预杂交液(约60μl/玻片),覆盖parafilm膜,放湿盒中在48~58℃下杂交18-30h。
3.3杂交后处理
10.取出玻片,小心去掉Parafilm膜,甩掉杂交液,用52℃预热的5×SSC洗30min。
11.在无DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37℃下孵育30min。
12.分别依次用52℃预热的2XSSC,1XSSC和O.1XSSC洗2次,每次30min。
3.4杂交信号检测
13.在缓冲液A(0.1MTris-HC1pH7.5,0.15MNaC1)中平衡5min。
14.在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1:500~1:2000稀释于含0.5%阻断液的缓冲液A中),室温反应2h。
15.用缓冲液A洗2次,每次15min。
16.在缓冲液B(0.1MTris-HCl;0.1MNaCl;0.05MMgCl_2,pH9.5)中平衡5min。
17.硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中,每ml缓冲液B含有4.5μ1NBT和3.5μ1BCIP。在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。
18.充分显色后,用EDTA(1mMEDTA,pH8.0)洗15min终止反应。
19.在95%乙醇中洗lh以除去非特异的背景。
20.用蒸馏水洗15min除去可能存在的结晶体。
21.脱水、透明,用中性树胶封片。
22.充分干燥后在显微镜下观察、照相。

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