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流式细胞仪实验方法(4)

时间:2005-04-05 13:16来源:本站原创 作者:bioguider 阅读:

小鼠IL-4

方法10

小鼠IL-5

方法10

小鼠IL-6

方法11

小鼠IFN

方法9 or 方法12

小鼠TNF-

方法9

为防止细胞内细胞因子分泌到胞外,在培养的最后4-6个小时,需要使用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin,10mg/ml的BFA)
方法1:  只使用转染细胞检测
方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.
方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.
方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4+细胞在包被人CD3抗体的培养板中,使用含有重组人的IL-2(10 ng/ml,目录号202-IL-010)和IL-4(10 ng/ml,目录号204-IL-005)的培养基培养两天;细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天;最后收获细胞,使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时
方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days
方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)
方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激
方法8: PBMCs细胞使用重组人IFNg (10 ng/ml,目录号285-IF-100) 刺激2 小时,然后使用IFNg (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.
方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中,使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时
方法10: CD4+T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中,使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体,重组小鼠的IL-2(10 ng/ml,目录号402-ML-020)和IL-4(50 ng/ml,目录号404-ML-005)的培养基培养两天;然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天;最后收获细胞,使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。
方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时
方法12: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时

六、流式检测细胞染色基本过程(以全血为例)
1、 收获细胞:肝素钠抗凝的静脉血,按1:1与培养基混匀,加刺激剂,同时加蛋白转运抑制剂(参照说明书), 混匀后,37℃,5%二氧化碳培养4-6小时
2、 阻断Fc受体:用于消除非特异性的结合染色
① 在小鼠,可使用纯化的FcII/III受体的抗体(CD16/32),按照1ug/106细胞的用量,在染色缓冲液中4℃孵育15分钟,PBS清洗后,直接进行下一步染色。
② 对于人和大鼠,可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断
3、细胞表面染色
① 加适当的细胞表面染色试剂20mL于Falcon管中,加入100mL激活后的全血 (细胞浓度维持在2×106/mL) 混匀,室温暗处孵育15分钟;
② 加入溶血素,室温暗处孵育10分钟。(注意:PMA激活的全血可能会溶血不完全。)
③ 离心500g 5分钟,弃上清
4、固定和破膜
① 加固定剂,室温暗处孵育15分钟,离心500g 5分钟,弃上清;
② 加破膜剂温暗处孵育10分钟。(剂量参照说明书)
③ 加2~3mLPBS洗液,离心500g 5分钟,弃上清。
5、细胞内染色
① 加入荧光标记的细胞因子抗体,混匀,室温暗处孵育30分钟。
② 加2~3mL洗液,离心500g 5分钟,弃上清,加入500mLPBS上机或加入500mL 1% PFA固定后再上机

七、注意事项
1. 标本处理:避免使用络合钙的抗凝剂,如ACD与EDTA,因为它们会限制钙依赖性激活过程,推荐用肝素钠。此外LPS,一种常见的生物试剂污染物,是强细胞激活剂,可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析,超过8小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置。
2. 刺激激活:检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间,以保证最佳的检测效果。比如,要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激;如果用CD4做表面标记,由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调,所以培养时间不能太长,4-6小时为宜,否则CD4下调影响分析
3. 选择合适的对照:为保证结合的真是和可靠性,至少荧光设置以下对照:
① 未刺激对照:激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运,因此在激活过程中产生  的抗原与细胞因子会滞留胞内,未刺激对照也应包含BFA。
② 激活对照:激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否,如果未达到CD69期望的水平,则激活步骤出了问题,某一试剂可能失活,过期,制备不当或溶剂污染,需制备新鲜刺激剂重新实验。
③ 同型对照:使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
4. Fc受体阻断:使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色,在小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32(eBioscience, 目录号14-0161-81),在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32,在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。
5. 荧光素的选择:检测相对低表达细胞因子如IL-4时,应选用PE或APC标记;单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记;同时检测多种细胞因子时,弱表达的应选用PE或APC,FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-γ

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八、问题与解答

问题

原因

解决

(责任编辑:泉水)
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