免疫组织化学问题解答

免疫组织化学是一种什么方法？
免疫组织化学方法是一种把分子水平的物质准确具体表达出来的一种方法，这些分子水平的物质可能与癌细胞，细菌，病毒等等有关。自从成功地制作出这些特异性的抗体，使组织结构可以从分子水平中显示出来，这些特异性抗体可以与肿瘤细胞中特定的结构结合，这些抗体被称为单克隆抗体。把这些单克隆抗体孵育在组织切片上，与特定的靶细胞进行特异的反应。如单克隆抗体可以与癌细胞发生特异性反应，单克隆抗体可以从特定的肿瘤病人血细胞中获得。在组织切片中结合的抗体可以用棕色或红色显示出来。比如，对转移到骨组织中的肿瘤细胞进行标记实验，我们可以用前列腺特异性抗体进行标记，如显示出棕色或红色的阳性反应，我们可以明确地判断这个转移性肿瘤来自前列腺癌，有些转移的肿瘤距原发部位可能更远。免疫组织化学不仅能帮助准确地诊断出肿瘤的性质，还可以预测肿瘤预后的生物学行为。例如，我们可以知道所有组织细胞的增殖活性。这不是更有意义的实验吗？我们能够判定在一种肿瘤组织中，80%的细胞增殖抑制了其他10%的肿瘤细胞的增殖，我们可以判定出这种肿瘤细胞增殖率高，要比其他肿瘤生长迅速，进展快。
在其他方面，免疫组织化学染色可以指导某些肿瘤的化疗，如：可以测定女性乳腺癌细胞中携带雌激素受体的含量。如果癌细胞中雌激素表达阳性，病人可以进行三苯氧胺的治疗，雌激素能够促进乳腺癌细胞的生长，三苯氧胺有封闭癌细胞中雌激素受体的功能。在此过程中，携带雌激素受体的癌细胞是通过激素促进它生长的，而且，癌细胞增生可以通过三苯氧胺治疗来阻止其生长的。因此，免疫组织化学测定雌激素受体的表达情况，可以预测三苯氧胺治疗的意义。这仅仅是免疫组织化学应用中的一个小例子。免疫组织化学在确定组织起源中的应用前景是无限的。免疫组化技术是一个复杂的生物技术，对每一个抗体标记物都有独自特定的染色方法，目的是能够明确各种组织起源，判定组织中是否存在特异抗原。
病理医生是如何对癌症做出诊断的?
癌症病人就诊时，外科医生会在肿瘤部位取一小块组织，送给病理科医生。在病理科，送检的组织经过石蜡包埋，制作成非常薄的组织切片，切片再进行HE染色，然后病理科医生将切片放在显微镜下观察，观察送检的标本中有没有肿瘤细胞，并做出诊断是患何种肿瘤。不幸的是，许多肿瘤组织细胞在显微镜下看起来非常相似，以致于病理医生难以完全准确地判断出肿瘤的性质。在许多肿瘤病例中，鉴别诊断是非常困难的，因为只有明确了肿瘤的性质，医生才能针对每种肿瘤制定出最有效的治疗方案，目前已经从分子水平研究出肿瘤细胞的表面和细胞内有特异性的物质表达。过去在传统的光学显微镜下及电镜下所看到的组织切片中的结构，曾经幻想的分子水平的结构，已经有现代免疫组织化学技术证明，这个技术的整个过程就叫做免疫组织化学方法。
CD抗原
CD，即分化丛（clusters of differentiation）。第Ⅳ届国际免疫学会议命名委员会（1983，京都），根据T细胞表面的分化抗原存在丛集现象，将这种抗原命名为CD抗原。CD抗原不仅存在于T细胞，也存在于B细胞，巨噬细胞等。
交叉反应
指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面：
1． 抗原特异性。指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
2． 共同决定簇。即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
3． 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。
· 抗原决定簇。它是指在抗原分子上为免疫系统识别和作用的基团，是抗原的关键结构。抗原决定簇的种类有1016?/FONT>1018种之多。决定簇的数目称为决定簇的价数，较大的分子决定簇较多，如红细胞上的A或B血型抗原，其决定簇数目可能超过100万。
· 多抗和单抗特性比较
1. 均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类。即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化学组成。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物。
2. 稳定性。单抗的稳定较差，对PH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多抗的稳定性则较好。
3. 特异性。单抗是单一地针对抗原的某一决定簇，所以用它进行血清学反应时，特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应。
4. 重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。
沉淀反应
多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。
抗体的保存
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100Mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。
被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。
保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。
病理科成立免疫组化室需要哪些小设备（仪器）
1． 冰箱（4℃、-18℃）：贮存免疫试剂用。
2． 18cm不锈钢高压锅+电炉或家用微波炉。（抗原修复用）
3． 孵育盒（有机材料）；不锈钢或塑料耐高温切片架。
4． 冲洗瓶两个，定时器一个，10ml玻璃试管五个，塑料试管架。
5． 1000ul国产移液器两支，200ul进口移液器一支，20ul进口移液器一支，相应吸嘴。
6．磨砂玻片。
7. PAP油笔。
如何应用免疫组化进行病理科研设计？
科研课题的基本要求至少有四个，即创新性、科学性、可行性和推广应用性。关于创新性的重要性很好理解，谁喜欢东施效颦、拾人牙慧、人云亦云的文章？谁不想标新立异，“国内外尚无类似报道”？可对于病理科医生尤其是基层病理科医生，采用免疫组化技术进行创新性的科研，似乎免为其难。其实如果调整一下思维角度，难者也就不难了。我们在这里甘冒才疏学浅之嫌，介绍几种简单可行的创新性方法，以请教于病理界同仁。
方法之一，采用新抗体，这是最简单的办法。如金属蛋白酶MMP-9抗体是一种新抗体，其抗原MMP-9与肿瘤侵袭和转移有密切关系，但采用此抗体和免疫组化研究肿瘤侵袭、转移的文章国外少见，国内尚无，读者不妨一试。
方法之二，旧抗体新用途。比如关于凋亡及其相关因子表达与肿瘤发生发展的关系的研究，国内外有大量报道，而关于其非肿瘤疾病的关系的研究，却报道很少，有的甚至迄今未见报道。如果你将P53、bcl-2、c-myc、Bax、ICE等凋亡相关基因蛋白抗体用于非肿瘤性疾病研究，一定会获得新发现。再比如，P-糖蛋白抗体绝大多数用于肿瘤耐药性研究，却极少用于非肿瘤性疾病的研究。正常肝、肠道、肾等均表达P-糖蛋白，在非肿瘤性疾病时这种表达有什么改变，这种改变又有什么意义，迄今尚未了解，读者也不妨在这方面施展你的身手。
方法之三，同时应用多种抗体进行普通免疫染色或双重免疫染色研究二种或二种以上抗原的协同表达，只要这几种抗体选用合理，也比较容易获得新发现。
评价某种免疫学试验质量的指标
1． 诊断敏感性。指患者中因此试验得到阳性结果的百分率。计算方法：TP/（TP+FN）χ100%。理想试验的诊断敏感性为100%。
2． 诊断特异性。指正常人与无关疾病的患者中因此试验得到阴性结果的百分率。非患者的阴性结果为真阴性，其阳性结果为假阳性。计算方法：TN/（TN+FP）χ100%。理想试验的诊断特异性应为100%。
3． 诊断指数。为评价某种试验敏感性与特异性的综合指标。理想的指数应为200%，≤100%的试验不能成立。
4． 诊断效率。某种试验能准确区分患者和非患者的能力。计算方法：（TP+TN）/（TP+FP+TN+FN）×100%。理想试验的诊断效率应为100%。
5． 阳性预测值。指在所有阳性结果的人中，非患者的百分率，计算方法：TP/（TP+FP）×100%。理想试验的阳性预测值应为100%。
6． 阴性预测值。指在所有阴性结果的人中，非患者的百分率，计算方法：TN/（TN+FN）×100%。理想试验的阴性预测值应为100%。
免疫组织化学问题解答

免疫组织化学是一种什么方法？
免疫组织化学方法是一种把分子水平的物质准确具体表达出来的一种方法，这些分子水平的物质可能与癌细胞，细菌，病毒等等有关。自从成功地制作出这些特异性的抗体，使组织结构可以从分子水平中显示出来，这些特异性抗体可以与肿瘤细胞中特定的结构结合，这些抗体被称为单克隆抗体。把这些单克隆抗体孵育在组织切片上，与特定的靶细胞进行特异的反应。如单克隆抗体可以与癌细胞发生特异性反应，单克隆抗体可以从特定的肿瘤病人血细胞中获得。在组织切片中结合的抗体可以用棕色或红色显示出来。比如，对转移到骨组织中的肿瘤细胞进行标记实验，我们可以用前列腺特异性抗体进行标记，如显示出棕色或红色的阳性反应，我们可以明确地判断这个转移性肿瘤来自前列腺癌，有些转移的肿瘤距原发部位可能更远。免疫组织化学不仅能帮助准确地诊断出肿瘤的性质，还可以预测肿瘤预后的生物学行为。例如，我们可以知道所有组织细胞的增殖活性。这不是更有意义的实验吗？我们能够判定在一种肿瘤组织中，80%的细胞增殖抑制了其他10%的肿瘤细胞的增殖，我们可以判定出这种肿瘤细胞增殖率高，要比其他肿瘤生长迅速，进展快。
在其他方面，免疫组织化学染色可以指导某些肿瘤的化疗，如：可以测定女性乳腺癌细胞中携带雌激素受体的含量。如果癌细胞中雌激素表达阳性，病人可以进行三苯氧胺的治疗，雌激素能够促进乳腺癌细胞的生长，三苯氧胺有封闭癌细胞中雌激素受体的功能。在此过程中，携带雌激素受体的癌细胞是通过激素促进它生长的，而且，癌细胞增生可以通过三苯氧胺治疗来阻止其生长的。因此，免疫组织化学测定雌激素受体的表达情况，可以预测三苯氧胺治疗的意义。这仅仅是免疫组织化学应用中的一个小例子。免疫组织化学在确定组织起源中的应用前景是无限的。免疫组化技术是一个复杂的生物技术，对每一个抗体标记物都有独自特定的染色方法，目的是能够明确各种组织起源，判定组织中是否存在特异抗原。
病理医生是如何对癌症做出诊断的?
癌症病人就诊时，外科医生会在肿瘤部位取一小块组织，送给病理科医生。在病理科，送检的组织经过石蜡包埋，制作成非常薄的组织切片，切片再进行HE染色，然后病理科医生将切片放在显微镜下观察，观察送检的标本中有没有肿瘤细胞，并做出诊断是患何种肿瘤。不幸的是，许多肿瘤组织细胞在显微镜下看起来非常相似，以致于病理医生难以完全准确地判断出肿瘤的性质。在许多肿瘤病例中，鉴别诊断是非常困难的，因为只有明确了肿瘤的性质，医生才能针对每种肿瘤制定出最有效的治疗方案，目前已经从分子水平研究出肿瘤细胞的表面和细胞内有特异性的物质表达。过去在传统的光学显微镜下及电镜下所看到的组织切片中的结构，曾经幻想的分子水平的结构，已经有现代免疫组织化学技术证明，这个技术的整个过程就叫做免疫组织化学方法。
CD抗原
CD，即分化丛（clusters of differentiation）。第Ⅳ届国际免疫学会议命名委员会（1983，京都），根据T细胞表面的分化抗原存在丛集现象，将这种抗原命名为CD抗原。CD抗原不仅存在于T细胞，也存在于B细胞，巨噬细胞等。
交叉反应
指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面：
1． 抗原特异性。指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
2． 共同决定簇。即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
3． 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。
· 抗原决定簇。它是指在抗原分子上为免疫系统识别和作用的基团，是抗原的关键结构。抗原决定簇的种类有1016?/FONT>1018种之多。决定簇的数目称为决定簇的价数，较大的分子决定簇较多，如红细胞上的A或B血型抗原，其决定簇数目可能超过100万。
· 多抗和单抗特性比较
1. 均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类。即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化学组成。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物。
2. 稳定性。单抗的稳定较差，对PH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多抗的稳定性则较好。
3. 特异性。单抗是单一地针对抗原的某一决定簇，所以用它进行血清学反应时，特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应。
4. 重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。
沉淀反应
多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。
抗体的保存
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100Mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。
被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。
保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。
病理科成立免疫组化室需要哪些小设备（仪器）
1． 冰箱（4℃、-18℃）：贮存免疫试剂用。
2． 18cm不锈钢高压锅+电炉或家用微波炉。（抗原修复用）
3． 孵育盒（有机材料）；不锈钢或塑料耐高温切片架。
4． 冲洗瓶两个，定时器一个，10ml玻璃试管五个，塑料试管架。
5． 1000ul国产移液器两支，200ul进口移液器一支，20ul进口移液器一支，相应吸嘴。
6．磨砂玻片。
7. PAP油笔。
如何应用免疫组化进行病理科研设计？
科研课题的基本要求至少有四个，即创新性、科学性、可行性和推广应用性。关于创新性的重要性很好理解，谁喜欢东施效颦、拾人牙慧、人云亦云的文章？谁不想标新立异，“国内外尚无类似报道”？可对于病理科医生尤其是基层病理科医生，采用免疫组化技术进行创新性的科研，似乎免为其难。其实如果调整一下思维角度，难者也就不难了。我们在这里甘冒才疏学浅之嫌，介绍几种简单可行的创新性方法，以请教于病理界同仁。
方法之一，采用新抗体，这是最简单的办法。如金属蛋白酶MMP-9抗体是一种新抗体，其抗原MMP-9与肿瘤侵袭和转移有密切关系，但采用此抗体和免疫组化研究肿瘤侵袭、转移的文章国外少见，国内尚无，读者不妨一试。
方法之二，旧抗体新用途。比如关于凋亡及其相关因子表达与肿瘤发生发展的关系的研究，国内外有大量报道，而关于其非肿瘤疾病的关系的研究，却报道很少，有的甚至迄今未见报道。如果你将P53、bcl-2、c-myc、Bax、ICE等凋亡相关基因蛋白抗体用于非肿瘤性疾病研究，一定会获得新发现。再比如，P-糖蛋白抗体绝大多数用于肿瘤耐药性研究，却极少用于非肿瘤性疾病的研究。正常肝、肠道、肾等均表达P-糖蛋白，在非肿瘤性疾病时这种表达有什么改变，这种改变又有什么意义，迄今尚未了解，读者也不妨在这方面施展你的身手。
方法之三，同时应用多种抗体进行普通免疫染色或双重免疫染色研究二种或二种以上抗原的协同表达，只要这几种抗体选用合理，也比较容易获得新发现。
评价某种免疫学试验质量的指标
1． 诊断敏感性。指患者中因此试验得到阳性结果的百分率。计算方法：TP/（TP+FN）χ100%。理想试验的诊断敏感性为100%。
2． 诊断特异性。指正常人与无关疾病的患者中因此试验得到阴性结果的百分率。非患者的阴性结果为真阴性，其阳性结果为假阳性。计算方法：TN/（TN+FP）χ100%。理想试验的诊断特异性应为100%。
3． 诊断指数。为评价某种试验敏感性与特异性的综合指标。理想的指数应为200%，≤100%的试验不能成立。
4． 诊断效率。某种试验能准确区分患者和非患者的能力。计算方法：（TP+TN）/（TP+FP+TN+FN）×100%。理想试验的诊断效率应为100%。
5． 阳性预测值。指在所有阳性结果的人中，非患者的百分率，计算方法：TP/（TP+FP）×100%。理想试验的阳性预测值应为100%。
6． 阴性预测值。指在所有阴性结果的人中，非患者的百分率，计算方法：TN/（TN+FN）×100%。理想试验的阴性预测值应为100%。