蛋白质组技术的研究进展(2)

1)肽质指纹术(peptide mass fingerprint, PMF)是由Henzel等人［27］于1993年提出. 用酶(最常用的是胰酶)对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量(MALDI-TOF-MS，或为ESI-MS)，这一技术能够完成的肽质量可精确到0.1个分子量单位. 所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比(理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的). 配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白.若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大［18］.

2)肽片段(peptide fragment)的部分测序. 肽质指纹术对其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质. 为进一步鉴定蛋白质，出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段. 用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸，形成梯形肽片段(ladder peptide)［28］. 首先以一种可控制的化学模式从N-末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量. 另一种方法涉及羧基肽酶的应用，从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段. 化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量精确至以区别赖氨酸(128.09)和谷氨酰胺(128.06)［18］. 或者，在质谱仪内应用源后衰变(post-source decay, PSD)和碰撞诱导解离(collision-induced dissociation, CID)，目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱. 因此，允许推断肽片段序列［29］. 肽片段PSD的分析在MALDI反应器上能产生部分序列信息. 首先进行肽质指纹鉴定. 之后，一个有意义的肽片段在质谱仪被选作“母离子”，在飞行至离子反应器的过程中降解为“子离子”. 在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段［30］. 但经常产生不完全的片段. 现在用肽片段来测序的方法始于70年代末的CID，可以一个三联四极质谱ESI-MS或MALDI-TOF-MS联合碰撞器内来完成. 在ESI-MS中，由电雾源产生的肽离子在质谱仪的第一个四极质谱中测量，有意义的肽片段被送至第二个四极质谱中，惰性气体轰击使其成为碎片，所得产物在第三个四极质谱中测量［31］. 与MALDI-PSD相比，CID稳定、强健、普遍，肽离子片段基本沿着酰胺键的主架被轰击产生梯形序列. 连续的片段间差异决定此序列在那一点的氨基酸的质量. 由此，序列可被推测. 由CID图谱还可获得的几个序列的残基，叫做“肽序列标签”. 这样，联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N-、C?端的距离将足以鉴定一个蛋白质［32］.

(4) 氨基酸组分分析. 1977年首次作为鉴定蛋白质的一种工具，是一种独特的“脚印”技术. 利用蛋白质异质性的氨基酸组分特征，成为一种独立于序列的属性，不同于肽质量或序列标签. Latter首次表明氨基酸组分的数据能用于从2-DE凝胶上鉴定蛋白质［33］. 通过放射标记的氨基酸来测定蛋白质的组分，或者将蛋白质印迹到PVDF膜上，在155℃进行酸性水解1 h，通过这一简单步骤的氨基酸的提取，每一样品的氨基酸在40min内自动衍生并由色谱分离，常规分析为100个蛋白质/周［3］. 依据代表两组分间数目差异的分数，对数据库中的蛋白质进行排榜，“冠军”蛋白质具有与未知蛋白质最相近的组分，考虑冠亚军蛋白质分数之间的差异，仅处于冠军的蛋白质的可信度大. Internet上存在多个程序可用于氨基酸组分分析，如AACompIdent，ASA，FINDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在PROP-SEARCH中，组分、序列和氨基酸的位置被用来检索同源蛋白质［2］. 但仍存在一些缺点，如由于不足的酸性水解或者部分降解会产生氨基酸的变异. 故应联合其他的蛋白质属性进行鉴定.

4 蛋白质组研究的百科全书数据库(database)

蛋白质组数据库(proteome database)被认为是蛋白质组知识的储存库，包含所有鉴定的蛋白质信息，如蛋白质的顺序、核苷酸顺序、2-D PAGE、3-D结构、翻译后的修饰、基因组及代谢数据库等. 例如，SWISS-2DPAGE数据库包括人类，细菌，细胞等物种的信息［34］. 其中，E.coli SWISS-2DPAGE数据库是EXPASY分子生物学服务器的一部分，通过www的URL网址http://www.expasy.ch/ch2d/ch2d-top.html［35］可以查询.

当前的计算机和网络技术，让我们将所有的数据库连在一起，并允许我们从一个数据库中的一条信息遨游到其他的数据库；将一个研究对象的数据与其他各种蛋白质组中的相关数据或图谱相连. 分析型软件工具被称为蛋白质组分析机器人、数据分析软件包. 在既定的状态下，定量研究蛋白质的表达水平，或者计算机辅助数据库系统建立可将实验推进一步.因此，蛋白质组分析技术联合蛋白质数据库，计算机网络和其他软件包合在一起称为蛋白质组的机控百科全书(Cyber-encyclopaedia of the proteome)［18］.

蛋白质组和基因组共同分析可以产生大量的数据. 当评估每一个数据库的价值时，难免要考虑两个条件：1)数据库是否在任一时刻保持最新；2)何时能够相互连接，且以整体状态评估. 目前的发展趋势：1)信息量呈指数增长；2)蛋白质组计划的实施会产生新的数据库；3)致力于模拟细胞内蛋白质的相互作用的新型数据库；4)建立高级、智慧型的咨询工具是必需的［18］.

5 蛋白质组技术的规模高流通量筛选（HTS）

HTS(High throughput screening)至今在蛋白质组研究中已成为现实. 在最近的一年内，由于制药工业对此的需求，样品输入自动化得以进展. 目前，正在设计的机器人可自动处理2-DE后电转至PVDF膜. 原形机器人加工、传输蛋白质至质谱或以液相色谱为基础的分析仪，如进行斑点切割，操纵、控制多种PMF、氨基酸组分分析所需的化学反应，使每天最小的流通量达1000个蛋白. 此外，必须选择适用的软件包，如应用第二代COMBINED来处理输出的数据，自动咨询本地或网上的数据库而进行系列的评估. 大量的数据分析表明HTS是刻不容缓的. 目前，对质谱已设想一个三级方案来处理大规模的蛋白质组：1）MALDI-TOF-MS以每天大于1000个蛋白的速率分析；2）通过ESI-MS/MS或SEQUEST，以每天每台机器分析几打蛋白质的速率进行序列标签；3）对由串联质谱所得的新蛋白或有意义蛋白进行全长肽段的测序，从而提供足够的信息通过核酸探针或简并PCR引物获得有意义的基因［2,36］.

综上所述,高分辨率、高敏感性和高流通性的分离和分离后鉴定技术,结合准确、全面的数据库技术, 使蛋白质组技术用于生物研究卓有成效. 但仅鉴定蛋白质是不够的，蛋白质组世界的挑战是完善蛋白质质和量的分析,设想细胞活性、功能的全体性概念. 在此基础上,蛋白质组分析将会促进未来生命科学的整体发展.

(责任编辑：泉水)

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