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质粒提取(2)

时间:2005-04-05 22:20来源:本站原创 作者:bioguider 点击: 2111次

(一)聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA
1)将核酸溶液所得]转入15mlCorex 管中, 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液,充分混匀,用合适转头于4℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。
2)将上清转移到另一30mlCorex管内,加等量的异丙醇, 充分混匀, 用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10 000转/分离心10分钏, 回收沉淀的核酸。
3)小心去掉上清,敞开管口,将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁,流尽乙醇,用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴,敞开管口并将管侄置,在纸巾上放置几分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
4)用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转到一微量离心管中,于室温放置30分钟。
5)加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl,充分混合,用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟,以回收质粒DNA。
6)吸出上清,用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。
7)将水相转到另一微量离心管中,加100μl 10mol/L乙醇铵,充分混匀,加2倍体积(约1ml)乙醇,于室温放置10分钟,于4℃以12 000g离心5分钟,以回收沉淀的质粒DNA。
8)吸去上清,加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。
9)吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
10)用500μl TE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀释[用TE(pH8.0)] 后测量OD 260,计算质粒DNA的浓度(1OD260=50μg质粒DNA/ml), 然后将DNA贮于-20℃。

 

(责任编辑:泉水)
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