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放射性碘标记(2)

时间:2005-04-06 14:20来源:本站原创 作者:bioguider 阅读:

0035

  131I

8.05

0.6080.3350.250

0.3640.6370.722


  大多数抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改变了抗原的分子结构,往往容易损伤抗原的免疫化学活性;且放射性碘的半衰期较短,标记物放置后因衰变使放射性降低,因而需要经常制备标记物或要求能定期提供放射性碘标记都能适用,放射性碘放出γ-射线,用一般晶体闪烁计数器就能获得较高效率而精确的测量,测量操作也很简单。由于这些突出的优点,目前在放射免疫分析中,使用放射性碘标记物最多。
  从应用角度来看,131I和125I又各有其优缺点,可根据实验的要求、仪器的条件和放射性碘制剂的规格等条件合理选用。但相对而言,125I有较多的优点,一是半衰期适中,允许标记化合物的商品化及贮存应用一段时间;二是它只发射28keV能量的X射线和35keV能量的γ射线,而无β粒子,因而辐射自分解少,标记化合物有足够的稳定性。放射性碘适用于放射免疫分析许多对象(包括蛋白质、肽类、固醇类、核酸类以及环型核苷酸衍生物等)的标记,且操作简单,一般实验室都不难做到。
  二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记
  要制备高比度、高纯度与免疫化学活性好的标记物,首先要有高纯度、良好免疫活性的抗原。用作放射标记加网免疫分析的特异性,所以若用纯度不高的抗原作标记,则标记后必须采取适当的步骤除去杂质,以获得高纯度的标记物。标记对象的纯化应尽量采用温和的方法,否则在纯化操作中已受潜在性损伤的蛋白质(这时表面上活性可能还是良好的),再经标记反应时所受的损伤,活性就会显著降低,影响以后的放射分析结果。有了好的纯抗原,还要采用适当方法加以标记,尽量获取高比放射性、而又能保持良好的特异免疫化学活性的标记物。这些都是放射免疫分析能取得高特异性和高灵敏度的关键问题。
  多肽激素与蛋白质多用碘标记,最常用的是125I。碘化反应的基本过程如下:通过氧化剂的作用,使碘化物(125I-)氧化成的碘分子(125I2),再与多肽激素、蛋白质分子中的酪氨酸残基发生碘化作用。所以不管采用哪一种放射性碘标记法,标记的化合物内部必须有碘原子可结合的基团,即结构上要含有酪胺基或组织胺残基。凡蛋白质、肽类等抗原,在结构上含有上述基团的可直接用放射性碘进行标记。如不含上述基团的,放射性碘无法标记,必须在这些化合物的结构上连接上述基团后才能进行碘标记。
  因此影响蛋白质、多肽碘化效率的因素,主要决定于蛋白质、多肽分子中酪氨酸残基的数量及它们在分子结构中暴露的程度;此外,碘化物的用量、反应条件(pH、温度、反应时间等)及所用氧化剂的性质等也有影响。
  常用的标记方法有:
  (一)氯胺T法
  氯胺T法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得,是目前使用最多的碘标记方法。
  1.原理氯氨-T(Chloramine--T)是一种温和的氧化剂,在水溶液中产生次氯酸,可使碘阴离子氧化成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基位的一个或两个氢,使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。
 
  2.方法以125I-AVP的制备为例。
  (1)碘化反应:AVP5μg+0.5mol/l PB50μl(pH7.5)+1251800μCi,混合后,加入新配置的Ch-t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振荡混匀,室温下反应40s。
  (2)终止碘化反应:加入还原剂偏重亚硫酸钠40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以终止碘化反应。
  (3)Bio-Gel P2层析纯化:将碘化反应混合液注入Bio-Gel P2柱,用0.1n HAC溶液洗脱,分部收集,每2min收集一管,共收集60管。
  (4)放射性测量:测定各收集管的放射性,出现两个峰,第一峰为125I-AVP,第二峰为游离碘盐峰。第一个峰中计算最高的几管,留下备用。
  为了解标记抗原的质量,每次碘标记后应计算出碘的利用率,标记上多少放射性碘,以及每微克抗原结合上多少放射性碘。
  (5)标记抗原的贮存:经纯化与检查后的标记物、加入1/8体积的异丙醇,分成若干小份,置于铅罐中,在-20℃以下的冰箱中贮存备用,应避免反复冻融。标记抗原在贮存中是不稳定的,这是因为:一是脱碘,标记的碘从原来位置上脱落,变成游离碘;二是蛋白损伤、变性,成为聚合大分子或断键成小分子碎片。由于上述原因,使B/F明显降低,标准曲线斜率变小,以致不能使用,故需分离纯化,其方法是用Sephadex G100长柱(40~80cm )过柱,洗脱后出现3个峰。第1个峰分子量大,是蛋白变性的聚合的大分子,尚保留部分抗原决定簇,免疫活性弱;第2个峰是纯抗原的蛋白峰,免疫活性好;第3个峰是游离125I或小分子碎片,不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰,免疫活性好;第3个峰是游离125I或小分子碎片,不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰,其性能类似于新鲜标记的抗原。分离纯化的方法解决了标记抗原的贮存、长期使用问题,特别对来之不易的抗原更显得重要。
  2.注意事项
  (1)放射性碘源的选用:无载体的131I或125I均可用于碘化标记,但应尽量选用新鲜的、比放射强度高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比放射强度最好≥50~100mCi/ml,至少也要>30mCi/ml,否则加入碘源的容量要增加,随着带入碘源中含有的还原剂(为放射性碘源运输保存所需加入)量也增加,这将会显著降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。放置较久和放射性碘源,一方面因衰变致比放射强度降低,另一方面因水的辐射化学产物增多(主要是131I源),都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂(如Na2S2O5等)量多时,会抵消氯胺T的作用,降低碘利用率,甚至导致标记完全失败。放射性碘源要用无载体的,标记所用全部用具和试剂必须不含碘;只要有极少量的碘的污染,非放射性碘就会稀释放射性碘,使放射性碘利用率显著降低。为了便于放射性防护和除污染,以及减少射线对蛋白质分子的损伤,标记投入的放射碘量不宜过大,一般以<5mCi为宜。
  (2)放射性碘与多肽、蛋白质用量的比例:这比例对标记结果的影响很大。如上述原因,一般标记时放射性投入量不宜过多,示踪实验室中常规每次只用1~2mCi,因而放射性碘与多肽、蛋白质用量的比值主要靠标记时投入的多肽、蛋白质用量来控制。当投入的放射碘量一定时,多肽、蛋白质用量多(即I/多肽、蛋白质比值低),能获得高碘利用率,但所得标记蛋白比放射强度低;相反多肽、蛋白质用量少(即I/多肽、蛋白质比值高),则碘利用率降低,但所得标记多肽、蛋白比放射性随此比值变化都有较大的变动;而当此比值<1后,则碘利用率再下降的幅率较小,标记多肽、蛋白比放射性也不会再增加多少。
  (3)氯胺T与偏重亚硫酸钠的用量及碘化反应时间:氧化碘化标记法中,会导致失活的最主要原因是氧化还原。氯胺T是氧化剂,早期用氯胺T法作碘化标记时氯胺T用量都比较大,或碘化反应时间较长,结果导致蛋白质结构和活性的严重损伤。氯胺T用量大,或长时间进行碘化反应,结果并不能使碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度提高多少,反而使标记多肽、蛋白活性下降。当用不含还原剂或还原剂很少的放射性碘源时,试以各种蛋白质(包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰岛素等)作微量标记,当氯胺T用量为20μg/0.1ml反应液、0~20。C反应20s,碘利用率都已接近或达到最大峰,再加大氯胺T用量和延长反应时间是没有必要的。随放射性碘源中还原剂增多,氯胺T用量也应增加,以达到预期的碘利用率,但决不应盲目加大氯胺T用量和延长碘化反应时间(通常反应时间不要超过1min),否则会导致标记多肽、蛋白质严重失活,不能用于实验。当然,减少氯胺T用量要在了解放射性碘源还原剂含量的基础上,否则碘源中还原剂量较多,双盲目减少氯胺T用量,就会使标记失败。一般用125I标记时,氯胺T用量要适当加大。加入氯胺T后必须迅速混匀,以防标记不均匀。氯胺T与偏重亚硫酸钠溶液要新配制的。
  氯胺T用量减少了,Na2S2O5用量也就可以随之减少。为保证按时终止碘化反应,实验时加入Na2S2O5一般都是过量的。氯胺T用量大时,加入Na2S2O5的剩余量也就会随之增加,这就可能加重某些对还原剂敏感的蛋白质或多肽生物活性的损伤。为此,Na2S2O5用量也不应过多。只要药品没有变质、试剂是新配的,以重量计算Na2S2O5加入量与氯胺T相同就足以保证终止碘化反应(按反应克分子浓度计算,Na2S2O5/氯胺T重量比约0.4),不要盲目加大用量,并应迅速将标记多肽、蛋白质从反应液中分离出来,以尽量减少多肽、蛋白质活性的损伤。
  某些蛋白质或多肽对氯胺T较敏感,还可进一步减少氯胺T用量、缩短碘化反应时间、降低反应温度,以保护蛋白质的活性。这对一些较容易丧失活性蛋白质或多肽的碘标记十分重要。
  (4)碘化反应体积:系指加入Na2S2O5终止反应前液体的总量。碘化反应体积愈小,局部反应物浓度愈高,所得碘利用率和标记多肽、蛋白比放射强度就愈高。所以,标记应采用比放射标记效果。当反应液量少(<0.2~0.3ml)时,反应体积对碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度的高低影响较大;当反应液量大(>0.5~1.0ml)时则影响较小。微量氯胺T法放射碘标记时,一般多控制碘化反应体积<100μl。
  (5)碘化反应温度:温度升高,碘化反应速度加快,碘利用率有所增加。但总的来看,反应温度的影响不很大,一般从0℃到20℃碘利用率相差不过百分之几,故一般在室温下进行标记操作就可能获得重复性好的结果。有些蛋白质或肽类极易丧失活性,则可在0℃进行碘化反应。
  (6)碘化反应的pH值:受氧化剂氧化生成的活性碘,对多肽链的酪氨酸基苯环羟基邻位的碘化作用,最适pH是7.3~7.8之间。当pH变化时,碘化位置也会发生变化,例如pH值较高时,组氧酸的咪唑环也可被碘化;当pH4~5时,活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羟基吲哚,导致肽链断裂。这些都会影响蛋白质或多肽的放射性碘化反应,或引起降解或失活。因此作放射性碘化标记时,除放射性碘源外,所有的试剂都应用适当的缓冲液配制,保证碘化反应在最佳pH条件下进行。
  (7)微量蛋白质或多肽的吸附损失:界面的吸附损失,在使用大量蛋白质或多肽类时是可以忽略的,但作微量法标记时投入的蛋白质或多肽类只在微克甚至毫克甚至毫微克水平,界面吸附导致的损失就不能忽略。例如制备131I-ACTH时,所用ACTH浓度低到50Pg/ml时,因表面吸附可损失10%~30%,甚至高达75%。改变pH、加入非特异性载体蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器时,能减少吸附,但不能完全消除。一般残留在反应管和滴管上的放射性为投入总放射性的2%~8%、残留在层析柱上折占5%~10%。残留量随标记蛋白比放射性强度而直线增减,残留者几乎全部都是标记蛋白。由此可见,微量蛋白质或多肽受吸附而损失的量是不容忽略的。由于微量蛋白质、多肽会被显著吸附而丢失,所以标记时投入蛋白质、多肽量过微(如<2μg)也是不适宜的,否则标记蛋白质、多肽的收回率会太低,并在计算上会造成较大的误差。
  (8)不同蛋白质、多肽碘化标记的差别:由于不同的蛋白质和多肽分子中含有的酪氨酸数目不同,而且其空间结构也不相同,分子中的酪按酸残基有的容易发生碘化反应,有的就不容易碘化,因此同样条件下进行碘化标记,不同蛋白质或多肽对碘的利用率是不相同的。不同蛋白质经碘化标记后生物活性受损的情况也各不相同。例如ACTH、促性腺激素释放激素(GRH)、促黄体激素释放激素(LRH)等多肽,碘化标记后容易丧失激素活性或与受体结合的活性;而AFP及人绒毛膜促性腺激素(HCG)等的碘化标记,则较容易保存良好的免疫化学活性。
  尽管不同多肽、蛋白度的碘化标记结果有所差别,但上述讨论的因素对不同多肽、蛋白质碘化标记的影响有共同的规律。掌握了这些因素,就容易成功地获得合格的标记物。
  不同多肽、蛋白质的分子量大小、理化性质各不相同,放射碘化标记反应后,可根据具体情况采取不同的方法将标记蛋白质(或多肽)与未反应的游离放射性碘及受损伤的标记物分开,常用的方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、各种电泳法等。
  (二)乳过氧化物酶法(LPO)
  本法反应温和,对抗原、抗体免疫活性影响小,已被广泛应用。缺点是标记率较低,一般为20~40%。
  1.原理此法是利用乳过氧化物酶(Lactoperoxidase)有促进微量过氧化氢对125I-的氧化作用,生成125I+,并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。
  2.方法以标记蛋白质抗原为例。
  (1)反应液组成:蛋白质2~5μg溶于磷酸缓冲液10~25μl中,加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl);
  (2)在室温保温7min;
  (3)加入H2O2200ng(10μl);
  (4)过7min再加入H2O2(3μl);
  (5)保温7min后,加入0.5ml、10mmol/L巯基乙醇以停止反应;
  (6)10min后加入NaI载体溶液1ml ;
  (7)按常规方法分离纯化。
  3.注意事项
  (1)LPO质量好坏,可直接影响标记率,LPO应在使用前新鲜配制,以防酶活性降低。
  (2)LPO用量应小于总蛋白质用量的1%,以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。
  (3)碘化反应速率分析表明,酶的催化速度很快。
  (4)碘化反应在pH4.0~8.5较宽范围内均可进行,最适pH值应依据蛋白质本身性质而定。
  (5)H2O2应保持低浓度,如高于0.1mmol/L,对酶的活性将有抑制作用。
  (三)Iodogen碘化法
  此法具有标记率高、反应体积小(3ml水平)、可用低浓度的125I原料、对多肽激素和蛋白质的免疫活性损失小、稳定等优点,系常规的碘化方法之一。
  1.原理 用Iodogen为氧化剂,对蛋白质和多肽抗原进行碘化标记,把125I直接引进分子中的酪氨酸残基上。标记过程中被标记样品不与Iodogen混合,标记后取出样品即停止反应,不使用任何还原剂。
  2.方法
  (1)标记之前,先把Iodogen溶于有机溶剂,涂于管底,并使之干燥。
  (2)标记时,将蛋白质溶液10~20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB)置于反应管中,反应管置于冰浴中。碘化时,125I与蛋白质克分子之比例为1~1.2。反应时间在温和的连续的搅拌下可达10min,从反应管中转移出反应混合液,使其反应停止。反应液转移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中,层析分离前再放置5min,使其未标记的碘离子还原成分子碘,以避免在带有缓冲液的柱中使白蛋白碘化。
  3.注意事项
  (1)涂有Iodogen的反应管,有氮气中密封,并贮存在-20℃条件下,至少可用3个月。打开管,使用时间很短。
  (2)碘化反应时间,7min时标记率达最高,10min时略有减少。PH6.0~8.5时,标记率最高。
  (3)Iodogen与蛋白质的比率是标记率的函数。最大的标记率是1克分子的Iodogen与8克分子或再多量之比。
  (四)酰化试剂(Bolton和Hunter试剂)法
  1.原理这个方法用酰化剂3--(4-羟苯基)丙酸-N琥珀酰胺酯(Bolton-Hunter试剂)做连接试剂,将125I标记在羟苯基的2,5位置上,再将琥珀酰胺酯水解,通过一个酰氨键将3--(4-羟基-5-125I-苯基)接在蛋白或多肽的末端氨基上。
  2.方法125I-Bolton-Hunter试剂可用氯胺T法自行制备,出已有该试剂的苯溶液作为商品出售。使用时取一定量的标记酯(μmol 蛋白用3~5μmol标记酯),用氮气吹除苯,投入欲标记蛋白5~10μg及缓冲液10~50μl,pH8.0~8.5为宜,在冰浴中反应15~30min后,加入多量氨基酸(如甘氨酸),使过量标记酯消耗掉以终止反应。
  此法避免了蛋白质与氧化剂的接触,又避免了与放射性碘原子的直接接触,可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤,适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心,引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂,需要接触较多的放射性,经二步反应,碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽,而适于分子量大于1万的蛋白质。
  三、放射性标记化合物的纯化与鉴定
  (一)纯化标记化合物的常用方法
  不论使用何种制备方法,要获得合格的标记化合物,都必须将反应物经过仔细的分离、纯化。另外,一些标记化合物,经过一定时间的存放后,往往会出现不纯物,而需再纯化。如碘标记生长激素(125--HGH),在刚标记的第2天,从Sephadex G-100过滤谱上可见,几乎所有的碘化HGH都集中在峰II;保存1个月后,峰II组份减少,峰I和峰III成分明显增加,峰I是集聚的标记生长激素,而峰III是不具有免疫活性的放射性化学杂质(图8--3)。
 
图8-3 125I-HGH的Sephadex G-100过滤谱
实线:新鲜制备的 125I-HGH 虚线:保存1个月的125I-HGH
  标记化合物的纯化方法,除制备比活度低而化学量又较多的标记物可用重结晶、蒸馏、萃取等常规方法外,一般需用微量分离技术,较方便的是层析法、离子交换法、凝胶过滤及高效液相层析法等。现以碘标记蛋白为例,说明以上各种方法的适用情况。
  1.凝胶过滤法常用的是Sephadex G系列,也有Biogel-P系列。分离标记蛋白与无机碘时,通常用Sephadex G-25或G-50,然后用G-100进一步纯化。
  2.离子交换法一般是制成离子交换层析柱,用于分离纯化短肽标记物。
  3.透析法 能将标记蛋白与小分子化合物很好地分离。
  4.电泳法可用来分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质。
  5.亲和层析法利用蛋白质与其特异抗体或受体的结合来分离、纯化标记蛋白质。此法特异性强,保持生物活性好,但操作较复杂。
  6.高效液相层析法此法最大优点是分离效果好、快速,但需特殊设备。
  7.伴刀豆球蛋白A(ConA)吸附法ConA是一种植物凝集素,对糖蛋白有良好吸附能力,因此适于分离标记糖蛋白。吸附的标记糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脱。

(责任编辑:泉水)
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