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导语：tau蛋白在神经元中的异常组装是包括阿尔茨海默病在内的多种神经退行性疾病的病理标志。在阿尔茨海默病患者的中枢神经系统中，组装的tau蛋白与细胞外囊泡相关联，这与其清除和朊病毒样传播有关。然而，组装的tau蛋白种类和细胞外囊泡的身份，以及它们如何关联，尚不清楚。本研究结合了定量质谱、冷冻电子断层扫描和单颗粒冷冻电子显微镜，研究了来自阿尔茨海默病患者的脑细胞外囊泡。研究者发现了主要由截短型tau组成的tau蛋白纤维，它们被包裹在富含内溶酶体蛋白的细胞外囊泡内。研究者观察到了多种纤维相互作用，包括将纤维束缚在细胞外囊泡限制膜上的分子，这表明了选择性包装。这些发现将指导对组装tau蛋白通过细胞外囊泡分泌的分子机制的研究，并为针对阿尔茨海默病中细胞外囊泡相关tau蛋白的潜在治疗和生物标志物策略提供信息。

tau蛋白纤维的“特洛伊木马”：细胞外囊泡介导的传播

阿尔茨海默病中tau蛋白的聚集（形成神经原纤维缠结）与神经元功能障碍和临床症状密切相关。tau蛋白病理被认为以“朊病毒样”方式在脑区之间传播，即错误折叠的tau蛋白作为“种子”，诱导正常tau蛋白发生构象变化和聚集。细胞外囊泡（包括外泌体和微泡）被怀疑是这种传播的载体，因为它们能携带生物分子在细胞间传递。

然而，tau蛋白纤维如何与细胞外囊泡结合、结合的是哪种tau蛋白种类、以及细胞外囊泡的身份是什么，此前均不清楚。本研究利用先进的成像和质谱技术，首次在分子和原子水平上揭示了阿尔茨海默病患者脑内细胞外囊泡相关tau蛋白纤维的结构和包装机制。

核心发现：截短型tau纤维被选择性包装在内溶酶体来源的细胞外囊泡中

1. 细胞外囊泡的异质性与富集内溶酶体蛋白的亚群

通过密度梯度离心从阿尔茨海默病脑组织中分离出8个细胞外囊泡亚群，并进行了定量质谱分析。结果显示：

• 细胞外囊泡亚群在蛋白质组成上高度异质，分别富集了来自质膜、内溶酶体和线粒体的蛋白。
• 包含tau蛋白纤维的细胞外囊泡主要富集在内溶酶体蛋白标记的亚群中，提示它们可能来源于多泡体（外泌体途径）或与溶酶体功能障碍相关。

2. 细胞外囊泡相关tau是截短型、高度磷酸化且组装的

• 细胞外囊泡相关tau主要是N端和C端截短的片段（约12和24 kDa），仅保留包含微管结合重复区的核心结构域。这与形成淀粉样纤维核心的tau片段（残基305-379）一致。
• 这些tau是高度磷酸化的（PHF1阳性）且不溶于去污剂sarkosyl，证明其处于组装成纤维的状态。
• 通过蛋白酶保护实验和冷冻电子断层扫描证实，tau纤维位于细胞外囊泡腔内，而非表面污染。

3. 冷冻电子断层扫描揭示纤维的“束缚”结构

冷冻电子断层扫描对完整细胞外囊泡的三维成像显示：

• 每个细胞外囊泡腔内含有3到超过50根tau纤维，长度在75-500 nm之间（比神经原纤维缠结中的纤维短）。
• 至少有一根纤维的一端通过“绳状”密度被束缚在细胞外囊泡的限制膜内侧。其余的纤维则通过侧向接触与此束缚的纤维或其他纤维相连，形成网络，没有游离漂浮的纤维。
• 束缚位点独特的结构（非侧向接触）暗示存在特定的锚定分子，可能介导了tau纤维向细胞外囊泡的选择性包装。

4. 单颗粒冷冻电镜揭示额外的结合分子

通过提取细胞外囊泡内的tau纤维并进行单颗粒冷冻电镜分析，确定了其主要结构为成对螺旋纤维（与经典阿尔茨海默病纤维相同）。

• 然而，与从总脑匀浆中提取的纤维相比，细胞外囊泡内的成对螺旋纤维在其核心结构域的内部孔隙中含有额外的、非蛋白的电子密度，提示结合了阴离子分子（可能是脂质或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等）。
• 这表明细胞外囊泡内的tau纤维具有独特的分子组成，可能影响其稳定性或传播活性。

结论与意义：为靶向tau传播提供新见解

这项研究是首次在近生理状态下，对阿尔茨海默病患者脑内细胞外囊泡相关tau蛋白纤维进行的高分辨率结构和原位分析。

• 概念突破：提出了tau纤维通过细胞外囊泡传播的“特洛伊木马”模型。纤维并非被动地、随机地被包裹，而是通过特定的锚定机制被主动地、选择性地包装进来自内溶酶体的细胞外囊泡中。这为开发阻断tau传播的治疗策略提供了精确的靶点（例如，破坏束缚或包装过程）。
• 病理意义：细胞外囊泡内的tau纤维是截短的。这种截短可能发生在蛋白酶丰富的内溶酶体环境中，并且可能增强了纤维的种子活性（促进聚集的能力），因为截短通常被认为能加速tau聚集。较短的纤维长度也可能使其更易于在细胞间转移。
• 治疗启示：
  • 靶向包装机制：干扰tau纤维与细胞外囊泡膜束缚的分子（如BIN1等衔接蛋白）可能减少病理tau的细胞间传播。
  • 靶向细胞外囊泡：开发特异性清除携带tau纤维的细胞外囊泡的药物（如抗体偶联的脂质体）。
  • 生物标志物：脑脊液或血液中细胞外囊泡包裹的截短型tau可能成为阿尔茨海默病进展或治疗反应的特异性生物标志物。
• 方法论价值：展示了结合冷冻电子断层扫描（原位观察）和单颗粒冷冻电镜（高分辨率结构）在复杂人体组织样本中研究疾病相关蛋白组装体的强大能力，为未来研究其他神经退行性疾病（如帕金森病、亨廷顿舞蹈病）中类似机制提供了范例。
• 与溶酶体功能障碍的联系：富含内溶酶体蛋白的细胞外囊泡亚群与tau纤维的关联，支持了“溶酶体功能障碍是阿尔茨海默病核心病理”的观点。tau纤维可能是在溶酶体降解失败后，通过一种代偿性的分泌途径（如分泌性自噬）被排出细胞外。

该研究的通讯作者之一说：“我们的研究首次让我们得以窥见阿尔茨海默病大脑中，tau蛋白纤维是如何被包装进‘快递包裹’（细胞外囊泡）的。我们发现这些纤维被‘拴住’在包裹的内壁上，表明这是一个高度调控的、而非随机的过程。这一发现不仅揭示了tau蛋白在大脑中传播的潜在机制，也为开发阻断这一过程、延缓疾病进展的新型疗法开辟了新的途径。” 这项发表于《Nature Neuroscience》的研究，通过前沿的结构生物学技术，为理解阿尔茨海默病的朊病毒样传播机制提供了关键的分子和结构基础。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41593-024-01801-5