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导语：甲基-CpG结合蛋白2基因的重复导致MECP2重复综合征。为了标准化MDS中重复的MECP2，研究者开发了一种高保真Cas13Y系统，能够靶向MECP2 mRNA进行降解，并在人源化MECP2转基因小鼠的大脑中降低蛋白水平。此外，在新生或成年MDS小鼠中，通过脑室内注射腺相关病毒递送hfCas13Y-gMECP2，恢复了失调的基因表达并改善了行为缺陷。值得注意的是，用AAV9-hfCas13Y-gMECP2治疗将MECP2转基因小鼠的中位生存期从156.5天延长至226天。此外，对猴子的研究表明，单次注射AAV9-hfCas13Y-gMECP2足以在广泛的大脑区域驱动hfCas13Y的强劲表达，MECP2敲低效率达到52.19 ± 0.03%，并显著降低了生物标志物基因GDF11的表达。研究结果表明，靶向RNA的hfCas13Y-gMECP2系统是治疗MDS的有效干预手段，为治疗其他剂量敏感性疾病提供了潜在策略。

基因重复疾病的“剂量困境”：从DNA到RNA的降维打击

MECP2重复综合征是由于MECP2基因拷贝数增加（重复）导致蛋白过度表达而引起的严重神经发育疾病。与Rett综合征（MECP2功能丧失）相反，MDS是一种“剂量敏感性疾病”：即使是微小的MECP2过表达也会导致严重的神经功能障碍。因此，治疗MDS的核心策略是降低MECP2的表达水平，但必须精确调控，避免矫枉过正。

传统的基因编辑方法（如CRISPR-Cas9）作用于DNA，存在永久性改变基因组、脱靶风险高、递送难度大等问题。本研究另辟蹊径，采用靶向RNA的CRISPR-Cas13系统，在不改变DNA序列的前提下，选择性地降解MECP2的mRNA，从而实现可逆的、剂量可控的蛋白下调。

核心发现：hfCas13Y系统在多种模型中安全、高效地挽救MDS表型

1. 系统优化：筛选高效且“高保真”的Cas13

研究团队首先筛选了多种Cas13变体（包括Cas13X、Cas13Y等），并针对人源MECP2 mRNA设计向导RNA。通过体外和细胞实验，鉴定出Cas13Y具有最高的敲低效率。更重要的是，他们引入了先前报道的高保真突变，构建了高保真Cas13Y。与野生型Cas13Y相比，hfCas13Y在高效降解靶标MECP2 mRNA的同时，显著减少了脱靶效应（即非特异性地切割其他RNA），提高了系统的安全性。

2. 在小鼠模型中验证：单次治疗，长效改善

研究者使用人源化MECP2转基因小鼠（携带额外拷贝的人MECP2基因，模拟MDS），通过脑室内注射腺相关病毒9型递送hfCas13Y系统：

• 高效敲低：单次注射后，在大脑多个区域（皮层、海马、小脑）均检测到hMECP2 mRNA和蛋白水平显著下降（约50%）。

• 恢复转录组：RNA测序显示，hfCas13Y治疗恢复了MDS小鼠中失调的基因表达谱，特别是与突触功能、神经元发育相关的基因。

• 挽救行为缺陷：治疗显著改善了MDS小鼠的运动功能、社交行为、焦虑样行为和癫痫易感性。

• 延长生存期：最令人震撼的是，治疗将MDS小鼠的中位生存期从156.5天延长至226天（延长近45%）。

• 广泛的治疗窗口：无论是在新生小鼠（模拟早期干预）还是在成年小鼠（模拟症状后治疗）中给药，均能观察到显著疗效。

3. 非人灵长类验证：迈向临床的关键一步

为了评估该策略在人类中的转化潜力，研究者在猕猴中进行了验证：

• 通过脑室内注射AAV9-hfCas13Y-gMECP2，在猴子大脑的广泛区域（包括皮层、海马、丘脑、纹状体等）实现了高效的病毒转导和hfCas13Y表达。

• 在注射后4个月，大脑中的MECP2 mRNA敲低效率达到约52%。

• 同时，GDF11（已知的MECP2下游靶基因，与Rett综合征/MDS病理相关）的表达也显著下降，证明了系统的功能性效果。

• 重要地，在猴子中未观察到明显的毒性或脱靶效应。

结论与意义：为“剂量敏感”疾病提供可转化的RNA疗法平台

这项研究首次在MDS小鼠模型和非人灵长类中，证明了基于RNA编辑（CRISPR-Cas13）的策略可以安全、高效地治疗基因重复疾病。

• 概念突破：提出了一种治疗“基因剂量失衡”疾病的全新范式。与在DNA水平敲除或修复相比，靶向RNA的策略具有可逆性、剂量可调和更高安全性的优势。这对于MDS这类需要精细调控蛋白水平的疾病尤为关键。

• 转化潜力：在非人灵长类中的成功验证是该研究最大的亮点之一。灵长类的大脑结构、发育进程和免疫反应更接近人类，这极大地增强了该疗法向临床应用转化的信心。单次脑室内注射AAV9即可实现广泛且持久的敲低，具有良好的临床可操作性。

• 安全性：高保真Cas13Y的设计是另一个关键创新。它解决了早期Cas13系统存在的“附带切割”脱靶问题，为RNA靶向治疗的安全性设立了新标准。研究中也未在猴子中观察到明显毒性。

• 更广泛的适用性：MECP2重复综合征只是“剂量敏感性疾病”的一个例子。该平台技术可被直接应用于其他因基因重复或过表达引起的疾病，如CHD2重复综合征、某些形式的外周神经病变（如PMP22重复），甚至某些癌症中癌基因的过表达。

• 与反义寡核苷酸的比较：目前已有针对MDS的反义寡核苷酸疗法进入临床试验。本研究提供的Cas13系统是一种基因疗法，理论上单次给药可实现更持久的疗效（AAV介导的长期表达），而反义寡核苷酸需要反复鞘内注射。两者各有优劣，但Cas13系统提供了一种重要的补充或备选策略。

该研究的通讯作者Hui Yang总结道：“我们的工作展示了一种精确的、可调节的RNA靶向策略，可以有效地使MECP2重复综合征小鼠模型和猕猴大脑中过表达的MECP2水平恢复正常。这项研究不仅为MECP2重复综合征患者带来了希望，也为治疗其他由基因剂量失衡引起的疾病提供了一个强大的、可转化的技术平台。” 这项发表于《Nature Neuroscience》的研究，通过创新的RNA编辑工具和严谨的转化医学研究，为攻克基因重复这一大类疾病开辟了新的、令人振奋的道路。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41593-024-01838-6