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胚胎心肌细胞的分离及培养（在无菌条件下操作）：

首先，选择适合实验需求的孕鼠胎龄。通过颈椎脱臼法处死孕鼠后，剪开腹腔，找到子宫并取出胚胎，将其置于冰PBS（mmol/L）溶液中（成分包括：NaCl 120、KCl 5.4、MgSO4 5、Na-Pyruvate 5、Taurine 20、HEPES 10、Glucose 20）。接着，去除胎膜及胎盘，用尖镊子将心脏取出，放入另一个盛有冷PBS的培养皿中。

在体视显微镜下，将心房和心室分离（注意在10.5 d之前，心房尚未发育）。随后，将心房和心室剪碎，分别置于酶解液中（胶原酶B：1 mg/ml，Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany；CaCl2 10 mmol/L，3 μl/ml）进行酶解，温度设为37℃，时间为35~37分钟。使用KB液（mmol/L：KCl 85、K2HPO4 30、MgSO4 5、EGTA 1、Na2ATP 2、Pyruvate 5、Kreati 5、Taurine 20、Glucose 20）终止消化，并震荡30分钟。

将分离得到的单个心肌细胞（约5×10^5~1×10^6个/ml）滴加2~3滴至预先铺有明胶的盖玻片上，加入含有20%胎牛血清的DMEM培养基（Gibco公司），置于37℃、5% CO2培养箱中培养。24小时后，选择跳动的心肌细胞进行膜片钳实验。

膜片钳实验的关键点：

在利用膜片钳技术研究离子通道时，细胞的形态结构必须完整、平滑，以便与玻璃微电极形成高阻抗封接。此外，在破膜形成全细胞记录模式后，细胞需保持良好的活性。因此，制备高质量的单个细胞是完成膜片钳实验的关键。然而，在分离细胞的过程中，溶液成分、pH值、酶种类及温度等多种因素都会影响分离细胞的数量和质量。

优化实验的经验与建议：

• 迅速取出胚胎并快速去掉胎膜和胎盘，以避免胚胎缺氧。
• 温度是影响分离细胞成功率的重要因素。将取出的胚胎心脏置于4℃的PBS溶液中，可减弱心肌组织的代谢，从而保护心脏组织。
• 酶的选择至关重要。由于胚胎心肌组织较为娇嫩，建议使用较温和的胶原酶B进行消化，而非常用的I型胶原酶。
• 细胞密度需适当控制。由于分离的单个细胞需要培养24小时，因此滴加至盖玻片上的细胞数量不宜过多，以免细胞生长过于密集，影响单个细胞的膜片钳实验。
• 分离过程中需严格保持无菌操作，以防止细胞污染，确保细胞的生长状态良好。

本文所述方法能够获得数量充足且质量较高的单个心肌细胞。由于分离得到的细胞直接贴附于盖玻片上，其贴壁性较好，适合用于膜片钳实验。经过24小时培养后，胚胎心肌细胞状态良好，并能够观察到心肌细胞的跳动。

参考文献：

骆红艳，唐明*，胡新武，宋桂利，梁华敏，杜以梅，张毅. 小鼠胚胎心肌细胞的分离及电生理特性.