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膜片钳技术（patch-clamp technique, PC）由原西德马普所的Erwin Neher和Bert Sakmann于1976年发明，最初用于神经细胞乙酰胆碱受体通道的研究。两人因该技术及其在医学研究中的杰出贡献荣获1991年诺贝尔生理学或医学奖。自20世纪80年代以来，经Hamill等人改进，结合原生质体、液泡等分离技术的成熟，膜片钳技术在植物细胞膜生物学和分子生物学研究中得到广泛应用，并取得丰硕成果。

1. 膜片钳技术原理

膜片钳技术是从一小片（约几平方微米）膜获取电生理信息的技术，即通过保持跨膜电压恒定（电压钳位），测量通过膜离子电流的大小。测量时，将尖端直径为1-2 μm的玻璃微吸管抛光后压在经酶清洁的膜表面，形成高阻封接（电阻可达10-100 GΩ）。由于电性能完全绝缘，微吸管阻抗相对较低，背景噪音降低。在微吸管内充灌适当盐溶液并施加电压，对膜片进行电压钳位，通过膜片离子通道的电流流入微吸管，由银电极引入测量电路，经放大处理后得到离子通道的离子流，从而了解离子运输、信号传递等信息。

玻璃微电极与细胞膜之间的高阻封接非常稳定，因此膜片钳可采用多种测量方式（图1）。

图1 膜片钳的几种测量方式：Cell-attached（细胞粘附式）、whole-cell（全细胞式）、slow whole-cell（慢全细胞式）、outside-out（外翻外式）、inside-out（内翻外式）。

玻璃微吸管仅压在膜表面的测量方式称为细胞粘附式。在此基础上，若在微吸管内作短暂脉动抽吸，吸破膜片，使微吸管与胞内导通，则形成全细胞式。全细胞式能对常规微电极难以研究的小细胞进行研究，又分为慢全细胞式和快全细胞式，前者用于研究药物对通道蛋白的影响，后者用于研究细胞分泌。在全细胞式基础上，抽起微吸管在空气中稍作停留，可得到“内面向外”和“外面向外”的膜片（也称“切割膜片”），这些小膜片在化学性质上被完全隔离，允许任意改变膜内外离子环境，观察其对膜通道的影响，分别称为“内翻外式”和“外翻外式”。此外，还有“开放细胞吸附膜内翻外式”和“穿孔囊泡膜外翻外式”等模式。

膜片钳记录到的是通道电流。图2记录的是悬浮培养的Chenopodium rubrum细胞液泡SV型通道的单通道电流。单通道电流由矩形脉冲构成，持续无规则，反映小分子构象变化。向上电流表示通道开放，向下表示关闭，其持续时间即通道开放和关闭时间。电流变化幅度表示离子在给定时间内通过通道的数目。通道开放和关闭的持续时间依赖于所施加电压及各种影响通道蛋白的因素（如Ca²⁺、pH、第二信使、磷酸化作用）。对开放和关闭时间间隔及电流大小等进行统计分析，可得到通道蛋白的分子动力学特点，如确定通道类型、开放通道平均数、离子流量等。目前，膜片钳技术的电流测量灵敏度已达皮安（pA）级，空间分辨率达1 μm，时间分辨率达10 μs。

图2 Chenopodium rubrum液泡膜SV型通道的单通道电流记录

2. 膜片钳技术在植物膜生物学研究中的应用

自利用膜片钳技术在植物细胞中证实离子通道存在以来，该技术以其独特优势被广泛应用于植物膜生物学研究。

物质运输

生物膜上主要有三种转运蛋白：离子泵、通道和载体。膜片钳技术能区分离子通道和载体：载体蛋白最大周转率为10⁴-10⁵次/秒，而离子通道每秒可传递超过10⁶个离子，二者运输速率相差100-1000倍。利用膜片钳技术，已证实植物细胞中存在多种离子通道，如K⁺通道、Ca²⁺通道、Cl⁻通道、NO₃⁻通道、有机酸离子通道（如苹果酸）等，并了解了其生理特性，加深了对植物营养物质吸收和运输的认识。

信号转导

细胞信号转导，尤其是逆境信息的感受和传递，利用膜片钳技术结合其他手段，大大加深了认识。例如，逆境（干旱、盐）胁迫下，植物叶片气孔关闭的作用模式：逆境条件下，根尖合成ABA，通过导管运输到叶片细胞质外体，ABA激活保卫细胞质膜上的非特异阳离子通道，Ca²⁺内流使胞质Ca²⁺浓度增加，激活K⁺外流通道，引起K⁺迅速大量外流，苹果酸含量下降，保卫细胞膨压丧失，气孔关闭。

应用膜片钳研究植物对病虫害侵袭的防御反应也取得较大成功。例如，用水稻特异激发子处理烟草时，真菌激发子诱导激活烟草细胞质膜上的Ca²⁺通道，提高通道开放几率，Ca²⁺内流增加，导致胞内Ca²⁺浓度上升，激活植物防御反应系统，阻止细胞死亡；随后胞质Ca²⁺继续激活蛋白激酶，引起级联反应，使质膜H⁺-ATPase再磷酸化，恢复正常细胞功能。

细胞分泌

膜片钳技术灵敏度高，结合细胞生理学与分子生理学技术研究细胞分泌机制非常有效。其原理在于细胞分泌的胞吐过程在细胞膜上进行，引起细胞形态改变和物质流动，导致膜片参数变化，尤其是伴随分泌活性，整个细胞表面积（与膜电容成正比）增加。通过测量细胞膜电容，可估计单细胞的分泌活性。在动物细胞中，已初步得到肥大细胞和嗜铬细胞的分泌调控模型，而植物细胞报道较少，可能与植物细胞分泌时表面积变化相对较小有关。

分子生物学研究

膜片钳技术也是研究转运蛋白基因克隆、表达和功能分析的有效手段。将转运蛋白基因的cRNA注射入卵母细胞，在卵母细胞内合成转运蛋白并以功能状态整合到细胞膜上，再应用膜片钳分析，可证实该基因结构与功能间的一致性。例如，注入不同量KAT1的cRNA以控制其在卵母细胞中的表达，膜片钳记录到K⁺内流量随cRNA量增加而上升，加入外源K⁺内流通道阻塞剂后，抑制常数随cRNA量增加而增加，说明KAT1属于K⁺内流通道。用此方法，对氨基酸、蔗糖、NH₄⁺、脯氨酸等的转运蛋白进行了深入分析。

此外，膜片钳技术还可用于转运蛋白的遗传特性、突变体和转导植株分析，以及转运蛋白分子运动、物质运输的动力学性质研究。