生物行移动版

通过该方法分离的质粒DNA可常规用于电泳分析、限制性内切酶消化、转化大肠杆菌、DNA测序、PCR以及大多数其他分子生物学技术。

实验步骤

1. 培养含有目标质粒的细菌过夜。

2. 通过离心收集细菌，并将其重悬于0.02倍培养体积的溶液I中。

3. 向该悬浮液中加入0.04倍培养体积的溶液II，通过轻柔的颠倒混匀管内容物数次。

注意：必须轻柔混合以避免细菌基因组DNA的机械剪切，从而污染质粒制备物。

4. 加入0.03倍培养体积的溶液III，颠倒混匀5-10次，然后剧烈摇晃试管5秒钟。溶液III的加入导致基因组DNA快速复性并沉淀。

5. 通过室温离心（小体积在微量离心机中最大转速离心5分钟，大体积在10,000g离心20分钟）沉淀细菌碎片。

6. 将清澈的上清液转移到干净的试管中。

7. 加入无DNase的RNase A（0.01倍上清液体积的10mg/ml储备液），混匀并在37℃孵育30分钟。

8. 使用酚/氯仿抽提去除污染蛋白，并通过加入等体积的异丙醇沉淀核酸。

9. 如前所述，通过离心收集核酸。

10. 用70%乙醇简短洗涤DNA，空气干燥5分钟。

11. 将DNA重新溶解在水或TE（每毫升原始细菌培养物使用10μl），加入等体积的13% PEG 8000、800mM NaCl，混匀并在冰上孵育30分钟。

12. 通过离心（室温下微量离心机离心10分钟或10,000g离心20分钟）收集纯DNA，用70%乙醇洗涤一次，并在真空下干燥。

13. 将DNA溶解在适当体积的无菌、超纯水或pH 8的TE中。