背景介绍 蛋白磷酸酶2C（PP2C）是一类依赖于Mg2+或Mn2+的丝/苏氨酸磷酸酶，在细胞信号转导、应激反应等生物学过程中发挥重要作用。PP2C活性检测对于研究其功能及调控机制至关重要。 实验流程 1. 酪蛋白磷酸化
使用Casein kinase I（CKI）对酪蛋白进行磷酸化。将Sigma酪蛋白（C-4765，5%溶液，56mg/ml）稀释至10mg/ml，配置500μl反应体系（50mM Tris-HCl，pH 7.5；10mM MgCl2；5mM DTT；2.5mg酪蛋白，部分去磷酸化；3000U CKI；500μCi γ-32P-ATP），于30℃孵育4小时。通过TCA沉淀法测定磷酸掺入效率，离心后计数放射性。 2. 原生质体裂解缓冲液（PLB）
配制PLB：20mM Tris-HCl（pH 7.5）、20mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、10mM DTT、0.5% Triton X-100、50%甘油。裂解前加入10μg/ml抗蛋白酶（antipain、leupeptin、pepstatin）、1mM PNSF。用于激酶实验时可加入1mM NaF、1mM NaVO3。每10^5原生质体加入50-100μl PLB，冰上孵育3分钟，离心1分钟。若分析膜蛋白则不离心。 3. PP2C反应体系
取2-10μl玉米原生质体提取物，配置25-50μl反应体系（50mM Tris-HCl，pH 7.5；10mM MgCl2（建议5mM）；5mM DTT），于30℃孵育30分钟，冰上冷却。对于大肠杆菌提取物，取1-2μl，25μl体系，30℃孵育15分钟。反应后加入冷TCA沉淀，计数放射性。可替换MgCl2为EDTA、EGTA+MgCl2、CaCl2+MgCl2等，检测不同条件下酶活。使用OKA、环孢素A、EGTA抑制PP1、PP2A、PP2B，H89、K252a、staurosporine抑制CKI。 4. 酪蛋白激酶活性检测
与步骤1类似，但使用细胞提取物作为酶源，50μl反应体系（Tris、DTT、MgCl2或CaCl2），加入10μl细胞提取物。 5. PP2C检测（大肠杆菌提取物）
参考步骤2和3，使用大肠杆菌提取物（有无IPTG诱导），3ml细胞重悬于100μl，稀释后取1-2μl用于25μl反应体系，30℃孵育15分钟。体系含10mM MgCl2、50mM Tris-HCl（pH 7.5）、5mM DTT。可替换MgCl2为EDTA、EGTA+MgCl2、CaCl2+MgCl2等。 6. 大肠杆菌表达系统操作
将PP2C基因克隆至pET19b载体，制备BL21感受态细胞。培养20ml LB至OD 0.9，冰水冷却，离心，依次用TfbI、TfbII处理，分装冻存。转化0.5μl质粒至10μl感受态细胞，冰上孵育20分钟，37℃热激2分钟，加入LB培养1小时，涂布含抗生素LB平板，37℃培养12小时。挑取菌落，接种LB（含Amp和Cam），培养至OD 0.8，加入IPTG至0.5mM诱导2小时。冰上冷却，离心，洗涤，冻存细胞。解冻后加入PLB（含5mM亚精胺），冰上孵育5分钟，离心，提取物用于PP2C检测或凝胶分析，-80℃保存数月。 实验提示 实验过程中注意缓冲液新鲜配制，蛋白酶抑制剂及时添加，放射性操作需严格遵守安全规范。不同金属离子和抑制剂可用于鉴别磷酸酶类型和活性。 (责任编辑：泉水) |