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描述

EMS（甲基磺酸乙酯）是一种常用的化学诱变剂，通过烷基化DNA碱基（主要是鸟嘌呤），导致复制时发生错配，从而引入点突变。本实验方案详细描述了利用EMS对酵母进行诱变的标准操作流程，适用于筛选温度敏感突变体或抑制子等遗传学研究。

实验步骤

1. 在30°C下，于YPD培养基中过夜培养50 ml酵母培养物。

2. 测定细胞密度，取相当于1×10^8个细胞的培养物转移至数个15 ml锥形管中。离心收集细胞，用5 ml无菌水洗涤一次，再用5 ml 0.1 M磷酸钠缓冲液（NaH2PO4，pH 7.0）洗涤一次。离心后，将细胞重悬于1.7 ml缓冲液中。

3. 将细胞转移至玻璃培养管中。在通风橱内，加入50 μl EMS（同时设置一管不加EMS的对照）。在30°C下于滚轴上孵育不同时间（20分钟至1小时）。

4. 在每个时间点，加入8 ml无菌的5%硫代硫酸钠溶液（已高压灭菌），以灭活EMS终止诱变。此时每管细胞悬液应含1×10^7 cells/ml。保存一份等分试样用于后续计算细胞存活率。

* 所有接触过EMS的玻璃器皿、塑料器具和溶液均需用5%硫代硫酸钠溶液冲洗以灭活EMS。

5. 将细胞在15 ml锥形管中离心，重悬于9 ml无菌水中。通过将不同稀释度的细胞涂布于YPD平板上（25°C培养），计算洗涤后的实际细胞滴度。细胞可于4°C保存。

6. 为测定细胞存活率，取步骤4中的等分细胞，稀释后涂布于YPD平板（约500个细胞/平板），30°C培养。计数菌落数，将各EMS处理时间点的存活率与未诱变细胞比较。选择存活率为60-70%的时间点用于后续实验。

7. 使用保存的细胞，将不同数量的细胞涂布于YPD平板上。同时涂布未诱变细胞作为对照。（可选：涂板前短暂超声处理细胞约10秒，以消除细胞团块。）若筛选温度敏感菌株的抑制子，则将一块平板置于25°C，另一块置于37°C培养，寻找在37°C平板上生长更好的菌落。若筛选温度敏感突变体，则将所有平板于25°C培养至菌落出现，然后影印接种至两块新的YPD平板，分别于25°C和37°C培养，寻找在37°C平板上生长受抑的菌落。

试剂配方

YPD培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖（固体培养基加2%琼脂）。

0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.0）：配制0.1 M NaH2PO4和0.1 M Na2HPO4，混合至pH 7.0。

5%硫代硫酸钠溶液：称取5 g Na2S2O3·5H2O，溶于100 ml蒸馏水，高压灭菌。

所需材料

EMS（甲基磺酸乙酯，剧毒，需在通风橱中操作）、YPD培养基、磷酸钠缓冲液、硫代硫酸钠、无菌水、玻璃培养管、15 ml锥形管、培养皿、滚轴培养箱、30°C和25°C培养箱。

注意事项

EMS是强致癌物，所有操作必须在通风橱中进行，并佩戴手套和防护眼镜。接触EMS的废弃物需用5%硫代硫酸钠处理后再丢弃。