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描述

T载体是一种经过改造的质粒载体，其两端带有单个胸腺嘧啶（T）突出，专门用于高效克隆由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物（后者在3'端带有腺嘌呤（A）突出）。本方法详细介绍了如何利用常规分子生物学试剂自制T载体，适用于实验室常规克隆操作。

步骤

1) 使用平末端限制性内切酶（如EcoRV）消化待用质粒（例如pBluescript SK-）。

2) 通过酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化消化产物。

3) 将DNA重新溶解于1×Taq PCR缓冲液中（推荐使用Promega的Taq酶及其缓冲液，但任何非校正性Taq酶均可），使终浓度约为1 μg DNA/20 μL。

4) 加入dTTP至终浓度2 mM（通常从100 mM储存液加入）。

5) 加入Taq聚合酶，使其终浓度为1单位/μg DNA/20 μL。

6) 将混合物在72°C孵育2小时。

7) 用酚/氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次。

8) 乙醇沉淀DNA，用70%乙醇洗涤，干燥后重新溶解于TE缓冲液中，浓度约为25 ng/μL。

9) 定量DNA（可通过凝胶荧光与标准品比较进行近似定量）。

10) 连接反应：使用约25-50 ng T载体和足量PCR产物，使插入片段与载体的摩尔比为3:1（推荐使用Gibco-BRL的T4连接酶及其PEG缓冲液）。

11) 在15°C连接过夜。

12) 取1/5连接产物转化感受态大肠杆菌（如DH5α，效率约为5×10^7 cfu/μg pUC19）。

试剂配方

10×Taq缓冲液（Promega）
Taq聚合酶（Promega）
酚/氯仿混合液
100 mM dTTP
TE缓冲液
无水乙醇
70%乙醇

耗材

无特殊耗材。

提示

1. 确保使用非校正性Taq酶，以保证PCR产物3'端带有A突出。
2. 连接反应中PEG缓冲液可提高连接效率。
3. 转化时使用高效感受态细胞可提高克隆成功率。