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Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞

一、原理

Percoll是一种包被乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，具有低渗透压（<20 mosm/kg H₂O）和低粘度，可形成密度高达1.3 g/ml的梯度。通过预形成的密度梯度，在低离心力（200–1000 g）下，数分钟至数十分钟内即可实现高效的细胞分离。Percoll扩散常数低，梯度稳定性好，且不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，也可将受损细胞及碎片与完整活细胞分离。

二、操作方法及注意事项

1. 不同浓度（密度）Percoll溶液的制备：将9份Percoll与1份8.5% NaCl或1.5 M PBS混合，达到生理渗透压，然后用生理溶液（0.85% NaCl或0.15 M PBS）稀释至所需浓度。常用浓度与对应密度如下：

Percoll浓度（%）：70、60、50、40、30、20
比重（g/ml）：1.090、1.077、1.067、1.056、1.043、1.031

2. 不连续密度梯度Percoll层的制备：先用牛血清湿润试管壁，去除多余血清，使后续叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，形成清晰界面。通常用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置；若相邻两层密度差较小，可将Percoll液放入注射器，针头斜面紧贴管壁，自然缓慢流下。

3. 装样：样品体积和细胞浓度因细胞类型而异。加样体积不宜过大，细胞浓度不宜过高，以免影响分离和回收效率。

4. 离心：通常采用400 g离心20–25分钟。由于多层Percoll间密度差较小，离心机加速和减速需缓慢平稳。

5. 取样：若目标细胞主要位于两层界面，可逐层去除Percoll液后收集界面细胞；若细胞分散于Percoll层中，则需逐层收集。收获含Percoll的细胞后，经两次洗涤即可用于培养或检测。

三、分离纯化细胞举例

1. 富含NK活性大颗粒淋巴细胞（LGL）的纯化：按顺序从下向上逐层加入50%、47.5%、45%、42.5%和40%五种不同密度的Percoll（10 ml试管，每层约1.2–1.5 ml）。从外周血分离的PBMC（1×10⁸细胞）悬于1 ml培养基中，装样、离心并取样。富含NK杀伤活性的LGL细胞通常位于42.5%与45% Percoll界面及上下两层中。

2. 纯化淋巴母细胞和去除死细胞：分别叠加50%和30% Percoll液。收取经PHA（或其他抗原、有丝分裂原）刺激的PBMC，或含较高比例异型淋巴细胞的PBMC（如肾综合征出血热患者），装样、离心并取样。管底为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度及回收率可达80%以上；30% Percoll表面为死细胞。收获的淋巴母细胞可用于表型、结构及功能研究。

四、人不同血细胞的漂浮密度

表：人不同血细胞的漂浮密度（g/ml）

红细胞：1.09–1.11
粒细胞：嗜酸性1.09–1.095，嗜中性1.080–1.085
单核细胞：1.050–1.066
血小板：1.030–1.060
淋巴细胞：1.052–1.077（B细胞1.062–1.075，T细胞1.065–1.077）
淋巴母细胞：1.065–1.077
自然杀伤细胞：1.050–1.070

五、Percoll梯度离心补充方案（英文部分翻译）

形成梯度
1. 向离心管中加入22 ml轻Percoll。
2. 使用20 G 3.5英寸脊髓穿刺针连接10 ml注射器，小心地在下方加入6 ml重Percoll。
3. 在48,000×g（JA-20转子约20,000 rpm，Beckman J2-21高速离心机）4°C离心15分钟。

分级分离
4. 小心地将上清液层叠在预形成梯度之上，避免破坏梯度！同时运行一个标记梯度（含已知密度彩色标记珠，Pharmacia）。
5. 同条件下48,000×g 4°C离心15分钟。
6. 在4°C下从底部通过移液器吸头连接聚乙烯管和蠕动泵收集1或2 ml组分。

去除Percoll
7. 收集19或38个组分至5/8×3英寸、10.4 ml离心瓶（Beckman #355603）。测定标记梯度中标记珠迁移距离。
8. 使用Percoll平衡液平衡配平。
9. 在180,000×g（70.1 Ti转子约60,000 rpm，Beckman L7-65超速离心机）离心30分钟；或100,000×g离心90分钟。
10. 收集上清液，弃去沉淀。

试剂
松弛缓冲液（不含EGTA）：100 mM KCl，3 mM NaCl，1 mM ATP(Na)₂，3.5 mM MgCl₂，10 mM PIPES pH 7.3。
轻Percoll（终密度1.040 g/ml）：10 ml 10×松弛缓冲液（含EGTA），26.4 ml未稀释Percoll（密度1.130），63.6 ml dH₂O。松弛缓冲液使Percoll等渗，且应含12.5 mmol/L EGTA。
重Percoll（终密度1.120 g/ml）：3 ml 10×松弛缓冲液（含EGTA），26.4 ml未稀释Percoll，0.60 ml dH₂O。
Percoll平衡液（终密度1.122 g/ml）：5 ml 10×松弛缓冲液（含EGTA），45 ml未稀释Percoll。