肠道神经系统是外周神经系统的重要组成部分，具有自主调控肠道功能的能力。近年来，随着单细胞RNA测序技术的发展，研究者对肠道神经系统的神经元组成和发育机制有了更深入的认识。本研究发表于《自然神经科学》，通过单细胞转录组分析，系统揭示了小鼠小肠黏膜下神经元的多样性、发育轨迹及其神经连接网络，为理解肠道神经调控机制提供了重要的分子和发育学基础。

背景：肠道神经系统由肌间丛和黏膜下丛组成，前者调控蠕动，后者主要调节分泌和局部血流。尽管肌间丛的神经元研究较多，但黏膜下丛的神经元组成仍不完全清楚。传统观点认为黏膜下丛主要由分泌运动神经元组成，感觉神经元的存在存在争议。本研究利用单细胞RNA测序结合病毒标记，首次系统鉴定出黏膜下神经元的分子特征和发育路径。

主要发现

1. 黏膜下神经元的三大核心类群

研究通过优化流式细胞分选，结合单细胞RNA测序，鉴定出三类主要的黏膜下神经元：smENC1、smENC2和smENC3。这些类群具有不同的分子特征：

• smENC1：表现为胆碱能（Chat、Slc18a3），表达Nmu、Calcb和Adgrg6，可能具有谷氨酸能（Grin1、Grin3a）。
• smENC2：胆碱能，表达Sst、Tac1和Vipr2。
• smENC3：非胆碱能，表达Vip、Npy和部分Th（甲状腺素），以及谷氨酸受体（Gria2-4）。

免疫组化验证显示，这三类神经元在不同肠段中的比例不同：在十二指肠/空肠中，smENC1占约40%，而在回肠中，smENC3占据主导地位（约51%），表明其空间分布具有特异性。

2. smENC1的特殊身份

smENC1被鉴定为黏膜下的intrinsic初级传入神经元，具有Dogiel II型形态（光滑胞体），轴突广泛分支，投射至多个绒毛。功能实验显示，在机械刺激下，smENC1与肌间丛的myENC6表现出类似的反应，提示其可能直接感知肠腔信号。不同于肌间丛的IPANs，smENC1不表达神经丝蛋白NF-M（Nefm），这解释了此前未检测到IPANs的原因。

3. 神经元之间的连接网络

利用病毒标记结合免疫组化发现：

• 同类神经元轴突末梢形成自连接（同型连接）；
• 不同类神经元之间存在双向连接（异型连接），如smENC1与smENC2/3之间相互投射；
• 配体-受体分析预测，smENC1可能通过Calcb–Calclr信号通路进行同型连接，smENC2与smENC3之间可能通过Sst–Sstr1和Vip–Vipr2信号相互作用。

所有三类神经元的轴突均紧密贴近肠嗜铬细胞（5-HT+），且表达多种5-HT受体（如Htr2b、Htr4），提示它们可能直接感知肠腔中的化学信号，而非仅依赖IPANs感知机制。此外，轴突也靠近肠上皮的杯状细胞和潘氏细胞，但远离血管，暗示其调节血管的作用可能为间接途径。

4. 发育轨迹与统一模型

在P7 Wnt1-Cre;R26RtdTom小鼠中进行单细胞RNA测序和发育轨迹分析，发现黏膜下神经元的发育遵循与肌间丛相似的二元分支路径：表达Etv1的分支A和表达Casz1的分支B。smENC3起源于分支A，经过NOS1+的短暂原型状态（pENC8）；而smENC1和smENC2源自分支B，经过NDUFA4L2+的原型状态（pENC1）。谱系追踪显示，幼鼠期大部分EGFP+神经元表达NOS1，但成年后仅少部分仍表达，且未表达NOS1的细胞多转化为VIP+神经元。这支持一个统一的发育模型：所有肠道神经元源自两个主要的发育分支，通过原型状态逐步分化，最终形成多样化的神经元类型。黏膜下神经元的多样性较低，可能与其发育时间较晚有关（神经发生窗口与肌间丛重叠）。

机制与意义

本研究提出了肠道神经系统神经元多样性的发育模型：神经祖细胞在神经发生过程中做出二元命运选择，形成不同的原型状态（表达NOS1或NDUFA4L2），随后进一步分化为多样的成熟神经元。该模型解释了不同层次神经元的发育路径，并强调了局部微环境对神经元表型的影响。这一机制框架为理解肠道神经调控及相关疾病提供了基础，尤其在炎症性肠病、肠易激综合征等疾病中，黏膜下神经元的功能异常可能是关键因素。此外，研究中发现的分子标记和连接网络也为潜在的药物靶点提供了线索，如5-HT受体和神经递质通路，可用于开发新型治疗策略。

临床转化潜力

本研究的分子标记和发育机制为肠道疾病模型提供了基础，尤其在炎症性肠病和肠易激综合征中，黏膜下神经元的功能异常与疾病的分泌和运动障碍密切相关。理解神经元的发育路径有助于开发针对特定神经元类群的靶向治疗策略。此外，研究揭示的神经连接网络和信号通路，为调节肠道分泌和血流提供潜在的药物靶点，如5-HT及其受体，可能成为治疗腹泻或便秘的新方向。未来，利用肠道类器官和光遗传技术验证这些神经元的功能，将推动肠道神经调控的临床应用。

研究局限与未来方向

• 局限性：本研究主要在小鼠模型中进行，尚需验证人类黏膜下神经元的分子特征和发育机制。突触连接主要基于形态学接近性，未进行电生理验证，功能方面仅测试机械刺激，未涉及化学或渗透压刺激。
• 未来方向：未来将在人类肠道类器官中验证黏膜下神经元的保守性，结合光遗传和钙成像技术，研究其在活体中的功能连接，特别关注smENC3中TH表达的生理意义及其在应激条件下的变化。