导语： 生发基质出血（GMH）是一种影响早产儿的破坏性神经发育疾病，但为何这一脑区的血管容易破裂仍不清楚。2024年9月30日，《自然·神经科学》在线发表了一项来自加州大学旧金山分校、加州大学圣地亚哥分校等机构的重要研究（2024年第27卷2115–2129页）。研究者发现，产前小鼠和人类大脑中的小胶质细胞以年龄依赖性方式与新生血管相互作用，且这些细胞的消融会减少小鼠神经节隆起（对应人类生发基质）中的血管生成。与此一致，来自对照早产儿的CD45+细胞的单细胞转录组学和流式细胞术显示，不同的免疫细胞亚群利用多种信号机制促进血管网络形成。相比之下，来自GMH婴儿的CD45+细胞则含有活化的中性粒细胞和单核细胞，它们产生包括azurocidin 1、弹性蛋白酶和CXCL16在内的促炎因子，破坏血管完整性并导致神经节隆起出血。这些结果揭示了大脑先天免疫细胞在区域特异性血管生成中的作用，以及这些免疫细胞的异常活化如何促进早产儿GMH。

研究背景：生发基质出血的未解之谜

临床重要性

• 生发基质（也称神经节隆起，GEs）是富含神经祖细胞的区域，产生GABA能神经元

• GMH：发生于20-40% 的30孕周前早产儿，可导致严重的神经发育后遗症（脑瘫、认知障碍、癫痫）

• 已知风险因素：血管不成熟、血流动力学波动、感染/炎症

• 核心问题：为何GEs的血管特别容易破裂？

小胶质细胞与血管生成

• 小胶质细胞是大脑的先天免疫细胞，在发育中** colonize** 脑实质

• 在动物模型中，巨噬细胞可促进血管网络形成

• 未知：人类产前大脑中，免疫细胞是否以及如何调节GEs的区域特异性血管生成？免疫激活如何导致GMH？

核心发现之一：免疫细胞-血管相互作用在GEs中富集

人类产前大脑（图1, Extended Data Fig. 1）

• 组织透明化 + 光片显微镜（GW14-35）：

  • GEs中血管分支密度和IBA1+细胞密度高于皮质板

  • GEs中更高比例的IBA1+细胞位于血管腔内或直接接触血管壁

• 免疫金电镜（GW17-22）：

  • 捕捉到IBA1+细胞穿越血管内皮、停留在血管周围间隙、围绕神经祖细胞等多个状态

小鼠胚胎（图2, Extended Data Fig. 2）

• E13.5-P0：GEs中IBA1+细胞密度高于皮质板

• 活体双光子成像（E12.5 Cx3cr1+/GFP）：

  • 观察到Cx3cr1+/GFP细胞跨越原始血脑屏障进入LGE实质

  • 超过半数记录细胞接触血管

• Csf1r敲除：完全消除IBA1+细胞 → GEs中血管密度降低（皮质板中无变化）

• PLX5622（CSF1R抑制剂）时间特异性注射：

  • E10.5-E16.5或E12.5-E18.5消融 → GEs血管密度降低

  • E6.5-E12.5消融 → 无影响

  • 结论：小胶质细胞在特定发育窗口（E10.5后）促进GEs血管生成

核心发现之二：人类产前大脑CD45+细胞促进血管生成（图3）

细胞分离与表征

• FACS分选CD45+细胞（GE和皮质板，GW15-23）

• bulk RNA-seq：

  • CD45+细胞富集小胶质细胞基因（AIF1, TMEM119, CX3CR1, CSF1R）

  • GW20-23 CD45+细胞富集血管发育相关基因（SOX18, CCN1, CCN2, APLNR, FN1）

• Matrigel血管生成实验：

  • GW20-23 CD45+细胞（10,000或20,000个）与HUVEC共培养 → 增加分支长度

  • GW14-19 CD45+细胞或CD45-细胞 → 无效

核心发现之三：单细胞转录组学揭示GE富集的CD45+亚型（图4-5）

11个免疫细胞亚型（60,595个细胞，GW17-23）

关键验证

• RNAscope + 免疫荧光：GE中HLA+细胞（c6） 和VAM（c4） 数量多于皮质板

• 流式细胞术（16个表面标记）：

  • 鉴定出小胶质细胞1（CX3CR1hiCD14-） 和小胶质细胞2（CD64hiCD14lo，含BAM）

  • CD45+CD31+细胞中，小胶质细胞2占~50%

• CellPhoneDB + NicheNet：

  • GW14-19：仅VAM与内皮细胞通讯

  • GW20-23：多数CD45+亚型与内皮细胞通讯，单核细胞信号最强（ITGB2-ICAM2、VEGFB、IGF1、TGFB1、TNF、CXCL16、IL1B）

核心发现之四：GMH中活化的中性粒细胞和单核细胞（图6-7）

GMH病例的血管病理

• GE中血管面积和分支点减少，血管腔内IBA1+细胞减少

• 无皮质板变化

GMH病例的免疫细胞图谱（scRNA-seq，2例GMH vs 2例对照，24-25 GW）

• 稳态小胶质细胞（c1a, c1b）减少，中性粒细胞（c9）显著增加

• 中性粒细胞高表达ELANE、AZU1、DEFA4（抗菌因子），以及MKI67（活化标记）

• 免疫组化：GMH中ELANE+细胞增加（GE和皮质板），许多共表达CD16

• 差异表达基因：

  • 下调：稳态小胶质细胞基因（CX3CR1, P2RY12, IGF1, SALL1）、整合素（ITGAV, ITGAX）

  • 上调：补体成分（C1QA/B/C）、单核细胞基因（CD14, S100A9, S100A8）、中性粒细胞基因（AZU1, ELANE, MPO, DEFA4）、趋化因子CXCL16

功能验证（图6j-o, 7a-i）

• 3D微血管模型（hMVEC）：

  • AZU1（100 μg/ml）→ 破坏VE-钙黏蛋白，增加通透性（70kDa葡聚糖泄漏）

  • ELANE和CXCL16（20 μg/ml）→ 类似效应

• Matrigel血管生成：

  • AZU1、ELANE或CXCL16 → 抑制CD45+细胞或VEGF介导的血管形成

• CXCL16+单核细胞在GMH的GE中增加

S1PR1信号轴（图7j-q）

• GMH内皮细胞上调S1PR1

• 内皮特异性S1pr1敲除（Cdh5-Cre;S1pr1fl/fl）：

  • E12.5：GE中IBA1+细胞增加，血管附着减少，CD68+囊泡增加

  • IBA1+细胞上调CXCL16和CD16

• 结论：内皮S1PR1信号失调 → 免疫细胞异常浸润 → 炎症因子产生 → 血管损伤

核心发现之五：ELANE/CXCL16暴露导致GE出血（图8）

体内实验

• E12.5孕鼠腹腔注射ELANE + CXCL16（各3 μg/g体重）：

  • E13.5胚胎：GE的VZ中血管面积减少，Ter119+红细胞聚集（出血）

  • 3/7胚胎出现脑室内出血

  • 皮质板无变化

• E13.5/E15.5注射，E17.5收集：

  • 无出血，但GE的VZ中血管面积减少

综合模型：GMH中免疫-血管互作的恶性循环

正常发育（GW14-23）

1. 小胶质细胞/单核细胞与内皮细胞通讯（ITGB2-ICAM2, VEGF, IGF1）

2. 促进GEs中复杂血管网络形成

3. VAM可能代表穿越中的细胞

GMH病理

1. 触发因素（感染、缺氧、炎症）→ 中性粒细胞和单核细胞活化

2. 释放ELANE、AZU1、CXCL16等促炎因子

3. 直接破坏内皮VE-钙黏蛋白 → 血管渗漏

4. CXCL16与内皮S1PR1相互作用 → 进一步破坏S1P梯度 → 更多免疫细胞浸润

5. 恶性循环：炎症 → 血管损伤 → 更多炎症 → GE出血

GEs的选择性易损性

• GEs中血管生成活跃，内皮细胞更不成熟

• GEs中免疫细胞-血管相互作用更密集（更多VAM、HLA+细胞）

• GEs中S1PR1上调可能使内皮对炎症更敏感

对早产儿GMH的临床意义

资源可及性

• RNA-seq数据：GEO PRJNA885959

• 代码：可从通讯作者处获取；血管分割和配准算法：https://github.com/LehtinenLab/Shipley2020

局限性与未来方向

1. 样本量有限：GMH scRNA-seq仅2例，需更大队列验证中性粒细胞亚型和CXCL16信号的普遍性

2. 因果关系：ELANE/CXCL16注射模型模拟了GMH，但未证明在人类中这些因子足以引起GMH（可能存在其他协同因素）

3. 时间窗口：GMH通常发生在出生后（早产儿），而小鼠模型在胚胎期注射，不完全模拟产后血流动力学变化

4. 物种差异：小鼠GEs血管生成时间窗口与人类不同，需谨慎外推

5. 临床异质性：GMH病例临床特征多样（Supplementary Table 1），部分病例ELANE+细胞未增加，提示存在不同亚型

未来方向：

• 前瞻性队列：收集早产儿脐带血，测量ELANE/AZU1/CXCL16水平，预测GMH风险

• 中和抗体：在GMH小鼠模型中测试抗ELANE、抗CXCL16抗体或S1PR1调节剂的预防/治疗效果

• 单细胞多组学：对GMH病例内皮细胞进行单细胞ATAC-seq，鉴定S1PR1上游调控因子

• 类器官模型：构建GE类器官 + 免疫细胞共培养，模拟GMH并筛选保护化合物

结语

这项研究首次系统揭示了产前人类大脑中免疫细胞与血管的相互作用及其在GMH发病中的关键作用。在正常发育中，CD45+免疫细胞（小胶质细胞、单核细胞、VAM等）通过ITGB2-ICAM2、VEGF、IGF1等信号促进GEs区域特异性血管生成。在GMH病例中，活化的中性粒细胞和单核细胞产生ELANE、AZU1和CXCL16等促炎因子，直接破坏内皮VE-钙黏蛋白，增加血管通透性；同时，内皮细胞S1PR1上调可能进一步破坏S1P梯度，加剧免疫细胞异常浸润，形成恶性循环，最终导致GE出血。该研究不仅解释了为何GEs特别容易出血（免疫-血管相互作用密集、内皮不成熟），还为GMH的早期生物标志物（ELANE、AZU1、CXCL16）和治疗靶点（蛋白酶抑制剂、CXCL16中和、S1PR1调节）提供了新思路。

原始论文：Crouch, E.E., Bhaduri, A., Andrews, M.G. et al. Proinflammatory immune cells disrupt angiogenesis and promote germinal matrix hemorrhage in prenatal human brain. Nat Neurosci 27, 2115–2129 (2024). https://doi.org/10.1038/s41593-024-01769-2