三维基因组结构在基因调控中发挥着核心作用。Hi-C等技术已揭示基因组被组织成拓扑关联结构域和区室，这些结构在细胞类型之间相对保守，但在不同细胞状态中可发生变化。然而，传统的批量Hi-C测量的是数百万个细胞的平均构象，掩盖了细胞间的异质性，并且无法将特定的三维基因组特征与单个细胞的转录组状态直接关联。这一局限在分析稀有细胞群体（如干细胞、早期发育细胞或肿瘤起始细胞）时尤为突出。
2024年8月7日，牛津大学Weatherall分子医学研究所的Jim R. Hughes和James O. J. Davies在《自然-遗传学》的“新闻与观点”中，对同期Zhou, T.团队发表的一项新技术——GAGE-seq进行了精彩解读。GAGE-seq是一种新型单细胞多组学技术，通过同时分析单细胞中的三维基因组结构和基因表达，将单细胞Hi-C与单细胞转录组学整合起来，为在复杂组织中分析稀有细胞群体推向了新的前沿。
核心内容：GAGE-seq技术的原理与优势
该技术的核心突破在于实现了在同一细胞中同时测量染色质构象和转录组，且不牺牲任何一种信息的分辨率。
1. 现有单细胞三维基因组技术的局限性
已有的单细胞Hi-C方法（如scHi-C、sci-Hi-C、scSPRITE）能够测量单个细胞中的染色质互作，但它们不能同时提供匹配的转录组数据。将单细胞Hi-C与单细胞RNA测序数据通过计算整合（即测量不同细胞群，然后进行关联分析）会丢失单细胞分辨率下的“基因型-表型”直接联系，并且无法确保Hi-C数据和RNA-seq数据来自完全相同的细胞或细胞状态。
2. GAGE-seq的技术流程
GAGE-seq通过微流控平台（如10x Genomics平台）实现了整合：
- 细胞通量：每个细胞被分配到独立的纳米微滴中。
- 染色质构象捕获：在微滴内，细胞被裂解，染色质用限制性内切酶切割，然后进行近端连接，形成嵌合DNA分子（代表空间邻近的基因组区域）。对这些分子进行测序，可获得该细胞的Hi-C互作矩阵。
- 转录组捕获：从同一微滴中分离信使RNA，进行逆转录和测序，获得该细胞的基因表达谱。
- 整合：通过微滴条形码将Hi-C数据和RNA-seq数据追溯到同一个细胞。
3. GAGE-seq的优势
- 真正的单细胞多组学：直接从同一细胞获得配对的三维基因组和转录组，消除了跨细胞整合的不确定性。
- 高分辨率：可在单细胞水平上解析TAD边界、染色质区室（A/B室）和染色质环。
- 稀有细胞分析：由于不需要预先分选稀有细胞群体（这可能导致细胞损失或应激），GAGE-seq可以直接从复杂组织中捕获稀有细胞，并同时表征其三维结构和转录状态。
- 可扩展性：该方法基于现有的商业化微流控平台，具有较高的通量和可重复性，适合分析数百至数千个细胞。
应用与发现
通过将GAGE-seq应用于小鼠胚胎干细胞分化模型和人造血干细胞/祖细胞群体，该研究取得了关键发现：
- 细胞类型异质性：在看似均一的细胞群体中，GAGE-seq识别出具有不同三维基因组特征（如A/B室强度、TAD边界清晰度）的亚群，这些亚群对应的转录状态也不同。这揭示了三维结构与转录异质性的直接关联。
- 动态变化：在分化过程中，GAGE-seq捕获到染色质构象的连续变化（而非“开关式”转变）。TAD边界的建立/消失先于或伴随着关键谱系特异性基因的表达变化，支持三维结构重塑是转录重编程的驱动因素之一。
- 稀有细胞状态：在造血干细胞/祖细胞群体中，GAGE-seq区分出“静息”和“激活”状态的干细胞，并发现处于激活状态的干细胞的染色质区室（A/B室）已部分偏向髓系，即使其转录谱仍保持干性。这表明三维结构的变化可作为细胞潜能转换的早期传感器，先于转录变化。
意义与展望
GAGE-seq的开发生物医学研究具有多方面的重要意义：
- 整合“4D基因组”：“4D基因组”研究的是三维结构在时间（第四维）上的动态变化。GAGE-seq可通过在单细胞水平捕捉三维结构和转录组的时间（伪时间）动态，重建分化或疾病进程中的4D轨迹。
- 揭示疾病中的结构异质性：在癌症中，肿瘤细胞的三维基因组常常发生重排（增强子劫持、TAD边界破坏）。GAGE-seq可用于分析肿瘤内不同亚克隆的三维结构异质性，并直接关联其转录表型（如转移潜能、耐药性）。
- 基础发育生物学：对于只有少量细胞可获得的胚胎发育早期阶段，GAGE-seq可同时分析每个卵裂球或胚层细胞的三维结构和转录组，揭示关键发育决定事件的结构基础。
- 未来方向：当前GAGE-seq的分辨率尚不能检测到单个染色质环（需要极高深度的测序），未来通过优化连接步骤和测序策略，有望提升环检测能力。可结合单细胞多组学，同时检测染色质可及性或组蛋白修饰。未来技术应降低对起始细胞数量的要求，并发展计算算法，以从稀疏的单细胞Hi-C数据中稳健地推断出群体层面的结构特征。
参考文献
- Hughes, J.R. & Davies, J.O.J. (2024). Single-cell technologies meet Hi-C. Nature Genetics, 56, 1542–1543.
- Zhou, T. et al. (2024). GAGE-seq concurrently profiles multiscale 3D genome organization and gene expression in single cells. Nature Genetics. https://doi.org/10.1038/s41588-024-01745-3
- Baysoy, A. et al. (2023). The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
- Granja, J. M. et al. (2021). Single-cell multiomic analysis identifies regulatory programs in mixed-phenotype acute leukemia. Nat. Genet.
- Hua, P. et al. (2021). Defining genome architecture at base-pair resolution. Nature.