(3)半胱氨酸的修饰。若肽链内Lys、Arg均较少，则为了增加胰酶的裂解点，可以将半胱氨酸进行氨乙基化，其产物S?β?氨乙基半胱氨酸有类似Lys的结构，胰蛋白酶在水解时，不能识别这微细的变化，从而在半胱氨酸处断裂。

蛋白水解酶的专一性

　　肽链的裂解和重组大致有三种情况：一种是非特异性裂解，如酸水解。由于裂解的片段较小，造成分离的困难。因此这种非特异性裂解对大分子肽链是不适用的。第二种是特异性裂解，采用两种以上的专一裂解，然后进行组合，这种方法一般也适用于分子量小于5万的蛋白质。第三种是逐步的专一裂解，首先将某种氨基酸进行化学修饰，使水解酶专一断裂某一种氨基酸，分成若干片段，然后解除化学封闭，再用此酶裂解，使曾被封闭过的氨基酸断裂。目前倾向于采用这种裂解方式。

　　3.肽段的分离

　　大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。单用凝胶过滤法分离之肽一般纯度不高，常需辅以离子交换层析法，大片段肽可用离子交换葡聚糖作载体，小肽则多用Dowex-50等树脂。

　　小肽分离还常采用高压电泳与层析相结合的指纹图谱法，得到纯净肽。

　　4.肽的顺序分析

　　在蛋白质一级结构的测定中，肽的顺序分析是比较重要的一步。肽的顺序分析也有化学法和酶解法两种。

　　1)化学法?Edman降解法

　　这是目前用于顺序分析的最主要的方法。它的原理是从N端开始，逐步降解。将肽先与异硫氰酸苯酯(PTH试剂)在pH8-9条件下作用，肽的NH₂末端接到异硫氰酸苯酯的C原子上生成苯异硫甲氨酰肽，简称PTC?肽，在强酸作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一个失去末端氨基酸的肽链。此肽不被破坏，因而又可出现一个新的N－末端。重复以上的步骤，继续与PTH试剂作用，继续分析，苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生物很不稳定，在水中可转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH－氨基酸)。这些步骤通常称为Edman氏逐步降解法。所以可用来测定氨基酸的排列顺序。Edman降解法的优点是样品用量少，灵敏度高。

　　PTH－氨基酸的鉴定可以用各种层析方法，如纸层析、薄层层析、气相层析和质谱法等，现在多用高压液相层析法。虽然此方法具有很多优点，但是由于操作繁琐，工作量大，所以目前有人根据Edman降解的原理作一系列改进。

　　下面简单介绍几种方法

　　A.1967年Edman及Begg介绍了一种Edman降解的液相自动分析装置，使顺序分析开始走向自动化。将样品先在反应杯内旋转成薄膜，使之固定。然后与PITC试剂反应。再用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂，因而样品易丢失，且仪器昂贵，使用受到限制。

　　B.1970年Laursen改进为固相氨基酸顺序仪。此法样品用量少，检出灵敏，可分析20?0肽，其原理是将肽共价结合到惰性支持物上，固定后装柱再行Edman降解。

　　固相顺序仪的惰性支持物有：

　　此法成功的关键是肽段的固定，目前采用C端α?羧基固定法，重复法高，其中以高丝氨酸内酯法及双异硫氰酯法(DITC)最好，固定率可达90-95%。

　　C.另外也有从化学反应的角度考虑，试图改进Edman方法。1976年有人将异硫氰酸苯酯的苯基改变为甲氨偶氮苯，试剂为甲氨偶氨苯?异硫氰酸盐(简称DABITC)。这是一种有色试剂，产物DABIH?氨基酸呈桔黄色，因此鉴定时无需染色，用肉眼即可分辨。此方法灵敏度很高，一次分析小肽段只要几个nanomole样品即可，是目前一种很可取的方法。此外也有人将异硫氰酸酯进行^?35S标记，使分析样品更向微量化方向发展。

　　2)酶解法?肽谱重迭法

　　分析肽段也可采用酶解法，利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽，比较两种方法所得之肽段的重复性，进行氨基酸顺序的装配。例如，有一个肽段，通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，则得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套寡肽。分析结果如下：

　　Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val

　　糜蛋白酶水解

　　+肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)

　　胰蛋白酶水解

　　Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val?

　　将此两套寡肽可以做分析比较，因为十肽的N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val，因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此类推如下?

　　水解酶也可运用二肽酶，两组可用同一种酶水解如第一套肽是A桞，C桪，E桭，G桯……第二套肽水解则先将该肽段N?端切去一个末位氨基酸，然后再开始二肽酶断裂，结果是A，B桟，D桬，F桮……这样分析比较也可排列出肽段顺序。

　　5.二硫键定位

　　蛋白质分子不经任何处理，直接用酶水解，检出其中二硫键的肽段，然后将二硫键拆开，分别测定两个肽的顺序，将此两肽结构与测出的一级结构比较，就能找出相应的二硫键的位置。

　　含二硫键肽的检出方法。

　　1)凝胶过滤或离子交换层析：用以分离各肽段，然后用特殊的二硫键显色反应找出含二硫键的肽。

图1-21 对角线电泳技术图解

　　2)对角线电泳或层析：1966年Brown及Hartlay提出用对角线电泳进行含－S-S-肽的定位，此方法是将水解后的肽混合物进行第一相电泳，样品点在中间，电泳毕，将样品纸条剪下，置于装有过甲酸的器皿中，用过甲酸蒸气处理2小时，使-S-S-断裂，此时含-S-S-肽段的静电荷发生了改变。然后将纸条缝于另一张纸上，进行第二相电泳电泳，电泳条件与第一相相同，只是与第一次方向成直角。在第二相电泳中，那些不含-S-S-的髣民泳情况与第一相相同，因此电泳后各肽斑均坐落在纸的对角线上，而那些含-S-S-的肽由于被氧化，电荷发生变化，第二相电泳速度就与第一相不同，电泳结果这些肽斑就偏离对角线，肽斑可用茚三酮显示。对角线法由于其速度快，操作简便以及能用于小分子样品，是直接分离-S-S-肽的好方法。

　　含-S-S-肽被分离后，即可进行肽段顺序分析，并与已测定的该蛋白质的一级结构进行比较，即可找出相应的-S-S-位置，至此蛋白质的一级结构基本阐明。

　　今后蛋白质一级结构的测定正朝自动化、快速化及微量化发展，关键问题仍然是进一步寻找蛋白裂解和肽分离的方法。

　　蛋白质一级结构的测定不断有新方法和新思路出现，如X衍射法测定一级结构；分离相应蛋白质的mRNA，由mRNA的一级结构排出蛋白质的一级结构等。这些大胆的设想必将有助于蛋白质的一级结构测定，使人们掌握更多的工具和方法去探索生命的奥秘。

(毛积芳、刘新平）