三、抗核仁抗体的检测法

　　用HEP-2细胞或大鼠肝细胞作抗原，作间接免疫荧光染色。结果可见细胞核核仁呈现明亮的黄绿色荧光。抗核仁抗体在硬皮病、皮肌炎、系统性硬化症等中最多见。

　　四、抗组蛋白抗体的检测方法

　　1．组蛋白的提取方法取大白鼠肝40g 加入160ml0.01mol/l Ph7.4 Tris HCl缓冲液，制成匀浆后进行浓度梯度离心（27000rpm×60min），沉淀物中加入蒸馏水90ml，再以超声粉碎仪将细胞打碎，离心（3000rpm×15min）取上清液，再加入一定量的1mol/l 硫酸，使硫酸的最终浓度为0.2mol/L,混匀后，离心（3000rpm×15min），取上清液，加入4～5倍体积的无水乙醇，置于-20^℃冰箱3天后，离心（3000rpm×15min）以乙醚洗涤沉淀，真空干燥，储存于-20℃冰箱中备用。

　　2．酸处理的鼠肾底物　 鼠肾冰冻切片（厚度4μm），以丙酮固定后吹干，密封，在-20^℃冰箱中储存备用。用前再于0.1mol/L盐酸中浸泡30min，然后再置于0.01mol/l pH7.4PBS中浸泡2次。

　　3．组蛋白重建的鼠肾底物在上述酸处理的鼠肾底物上加入30μl乙制备好的组蛋白，稀释浓度为25μl/ml，在室温中湿盒内孵育30min后，以0.01mol/l p7.4PBS浸2次。

　　4．检测方法用组蛋白重建的鼠肾底物，做间接免疫荧光测定。

　　5．结果1960年Kunkle首先在SLE中发现抗组蛋白抗体（Antihistone antibody ,AHA），是诊断药物性SLE的一项较好的指标。在活动期SLE中AHA可达90%。

　　五、抗着丝点抗体的检测方法

　　1．HEP-2细胞涂片的制备HEP-2细胞系人喉癌上皮细胞，在完全Eagle培养液中，37^℃，二氧化碳孵育48～72h，使细胞生长达到一定数量，约1.2～1.5×10⁶/ml，经胰酶消化后，可以传代或分装到置有玻片的培养皿中，继续用Eagle液培养及上述条件孵育，48h细胞不仅贴附于玻片上并已长成单细胞层。取出玻片用丙酮固定15min，自然干燥后待用，或保存于-20^℃或4℃中。

表15-3 各种抗核抗体及临床意义

　　注：Sm（Smith）；RNP：核糖核蛋白；Sn：为小核；SSB：干燥综合征B；SS-A：干燥综合征-A，Scl-70：硬皮病70，抗原分子量70000；PCNA：增殖细胞抗原；PM-1：多发性肌炎-；RANA：类风湿性关节　核抗原；dsDNA：双链DNA；ssDNA：单链DNA。

　　2．染色方法用间接免疫荧光法。

　　3．结果着丝点抗原是紧附于染色体着丝点的DNA蛋白质，当与相应抗体结合后荧光图型为约46个圆的荧光亮点。国际上多用HEP-2细胞，因这种细胞核大，分裂相旺盛，着丝点容易显露，这种抗体在进行性系统性硬化症（PSS）中阳性率可达31%～98%，是PSS的CREST型的标记抗体，CRESF是指具有软组织钙化，雷诺现象，食管功能低下，指端硬化，毛细血管扩张的PSS患者。

　　六、抗甲状腺自身抗体（Thyroid Autoantiodies）的检测方法

　　Roitt等（1956）和Witebsby等（1957）就发现桥本氏病人血清中有对甲状腺提取的抗体活性，后来White（1957）首次用间接免疫荧光染色方法研究桥本氏病人血清存在对甲状腺胶质（thyroid colloid）的抗体获得成功。此后，Landing等（1958）和Holbrow等（1959）以不固定的甲状腺切片作抗原。检查出慢性甲状腺炎（Chronie thyroiditis）病人血清中有和细胞浆结合而呈现明亮染色的抗体。Blizzard等（1960）,Doniach 等（1960）发现第二胶质抗体，血高γ球蛋白，沉淀素阴性，鞣酸细胞血凝试验阴性，抗甲状腺微粒体补体结合试验阴性。Balfoour等（1961）用免疫荧光法研究一些甲状腺病人时总结指出：甲状腺胶质抗体有三种不同的荧光形态：一种是呈三维状云絮状，是一种血清沉淀素阳性产生的抗甲状腺球蛋白抗体。另一种是胶质部分荧光呈裂纹形，胶质无明显阳性荧光，而胶质边缘和裂纹处呈明亮荧光，鞣酸化细胞血凝反应阳性，沉淀素反应阴性。第三种即上述的胶质呈均匀荧光形状，证实这是一种称第二胶质的抗体。近30多年的研究证明免疫荧光方法检查甲状腺自身抗体是一个特异、敏感、简便的方法，对于临床诊断和治疗，随访和预后，甲状腺某些疾病的自身免疫性质的发病机理研究等，都有一定的实用价值。我们20年大量研究结果也证明确实如此。用免疫荧光法检查甲状腺自身抗体已成为许多国家中，诊断甲状腺疾病的常规检查项目之一。

　　检查这种抗体的免疫荧光方法要求取正常人的甲状腺或手术摘出的甲状腺组织，用冰冻节　片（3～6μm）用作甲状腺球蛋白抗体检查切片需要经56^℃纯甲醇固定3min；用作甲状腺微粒体抗原切片无需固定处理，因固定会破坏微粒体的抗原性。按常规间接方法进行。

　　关于甲状腺抗体的研究已报告有甲状腺球蛋白抗体，微粒体抗体，第二胶质抗体，甲状腺刺激免疫球蛋白抗体，甲状腺激素T₄及T₃抗体，细胞表面的促甲状腺激素受体的抗体等。

表15-4 不同甲状腺疾病甲状腺自身抗体的阳性率（%）

　　七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测

　　Johnson（1965）首次用免疫荧光组织化学间接法在狼疮样肝炎病人血清中发现了SMA，用鼠胃滑肌作抗原。Whitingham用病人自身平滑肌作抗原，证实了SMA的自身免疫性。狼疮性肝炎或慢性活动性肝炎病人血清中SMA的阳性率可达80%以上。Donidht和Whitehouse先后报告了急生病毒性肝炎病人血清中SMA为IgM，而慢性活动性肝炎病人血清中SMA在发病初期（1～4期）为IgM，而后为IgG。Anderson利用纯化肌浆蛋白为抗原与肝炎病人血清中分离的IgM和IgM类SMA进行吸收试验，证明了SMA的特异性。Holborrow Gamel和Renbe先后观察了SMA与鼠肝细胞，肾小球及人的甲状腺上皮细胞和血小板等组织为抗原的免疫荧光染色结果，证明这些组织的抗原性均与平滑肌肌动蛋白有着共同性抗原。

　　现在多以大白鼠胃壁和肾组织血管壁平滑肌的4～6μm冰冻切片和抗原，附贴在干净的盖玻片上，电扇吹干，放入4^℃干燥剂中保存，用前可固定于95%（4^℃）酒精中1min，或不固定进行间接免疫荧光检测。

　　染色结果可见胃壁平滑肌，粘膜肌层和肌丝，小血管壁平滑肌等呈现出明亮的黄绿色荧光。有人用荧光检查急性期甲、乙二型肝炎暂时出现SMA的阳性率达80%，稀释血清应在1：10以上的确定为阳性，一般认为，肝细胞表面存在肌动蛋白样物质。慢性活动肝炎患者滴度在1：80以上，急性肝炎患者SMA属IgM类，滴度1：25以上，慢性迁延性肝炎患者SMA也常阳性，滴度1：25左右。使用皮质激素者SMA转阴或滴度降低。健康输血员用原血清或1：5稀释，常有9%～18%的低滴度SMA阳性，似无诊断意义，SMA与性别，年龄无关。

　　非肝病的SMA阳性者，主要见于传染性单核细胞增生症，类风湿性关节　炎，支原体感染疣，恶性肿瘤（如乳腺癌）。除传染性单核症滴度可达1：320外，一般常≤1:25，其血清与非肌性结构细胞不产生反应。

　　平滑肌抗体是抗肌球蛋白和肌纤维收缩蛋白的抗体，当肝细胞损害时，释放抗原引起的自身免疫反应。已证实慢性活动性肝炎病人血清中平滑肌抗体是具有特异性的血清学标志，但必须是高效价（1：80）以上，因在人群中常见低效价（1：10～1：20）。临床的研究指出，平滑肌抗体与生化指标改变程度相关，说明高效介平滑肌抗体与肝脏损害有关。Kurki等研究SMA在慢性活动性肝炎等的意义。

　　Middelton等报告检查了70例肾衰病人自身抗体，肾移植后3个月平滑肌抗体IgM类阳性率占76%，而移植前14%。SLE常是SMA呈阴性结果，可作鉴别诊断参考。

　　八、肝细胞膜抗体（Antibody to the hepatocyte membrane, HMA）的检测

　　Lee等用Rouin氏液固定的大白鼠肝切片作抗原，作间接免疫荧光（IIF）检查，在慢性活动性肝炎（CAH）病人血清中成功的发现了HMA，肝细胞膜呈现黄绿色荧光，12例CAH中11例HMA阳性（93%）10例原发性胆汁性肝硬化（PBC）全部阳性，20例胶元-血管疾病1例阳性（5%）7例非免疫肝病中1例阳性（14%），正常人22例中仅1例阳性（5%）。

　　Bouin氏液固定大白鼠肝冰冻切片和IIF检查HMA的方法很简便，特异，对于诊断CAH和PBC，研究病因是很有价值的。

　　免疫荧光方法：取Wistar大白鼠复合组织（胃窦、肾皮质和髓质和肝）用恒冷箱冷冻切片机作冰冻切片，4μm厚，贴于玻片上，在空气中干燥至少30min。在室温中用Bouin氏液（75ml饱和苦味酸溶液，24ml甲醛，19ml冰醋酸）固定10min。切片在pH7.40.01mol/L PBS中洗3次，15min，同时搅拌，切片在空气中干燥后立即应用，或存放在-20℃备用。作间接免疫荧光染色。

表15-5 平滑肌抗体在不同疾病中的百分率

　　九、线粒体抗体（Mitochondrial antibody, AMA）

　　用人肾（新鲜手术或尸检6h以内）采用肾皮质或大白鼠肾脏冰冻切片不需任何固定，作检查AMA抗体的抗原底物，间接免疫荧光结果可见远端肾小管上皮细胞浆呈现均匀的荧光。Walker等（1965）首先用此法在原发性胆汁性肝硬化，隐原性肝硬化和慢性活动性肝炎中发现AMA，以原发性胆汁性肝硬化（158例/188例）阳性率最高（84%），由于阻塞性肝胆疾病不产生这种抗体，可作鉴别诊断的指标。