在检测过程中要使用图像框（image frame）和测量框（measurement frame）。检测只在图像框内进行，框的大小按需要而定，测量框在图像之内，是进行测量的部位。两个框之间的部分称为保险区（图9-2）。

　　图像中每个被测物都有其特有的特征计算点（feature count point, FCP）,FCP在被测物的最底点，如图9-2中上面10个被测物的FCP均在测量框内，可计数或作其他测量，而最下面2个被测物的FCP不在测量框内，则不计在内，在测其他区域时再计算，有的被测可能被测量框截断，那么测量框外的那部分被测物应该位于保险区，即保险区要大于被测物，才能观察FCP是否在测量框内而决定取舍。这样当换到相邻的区域进行测量时，不会使某图形重复测量，可避免测量误差，图9-3显示放置标本的显微镜载物台的移动方式，可由计算机控制，用编制好的程序，使载物台按一定方式移动，也可以人工操作。图中可以看出每个部位都将通过测量框，不会遗漏。

图9-2　示测量框位置，图中有10个被测物的FCP在测量框内

　　5．阴影校正校正图像细节　直到正确无误并达到能被测量的要求。所谓阴影（shading）是指人眼看来是均匀的视场内存在着不均匀的电子反应，这使得灰度相同的图像成分由于在视场中所处位置不同而显示出不同的灰度，这种影响必须校正才能使图像得到准确测量。阴影有三个主要的来源：

　　（1）图像源的不均匀的光照。

　　（2）穿过透镜时光路发生变化引起的透镜阴影。

　　（3）显像管本身的图像灵敏度差异引起的扫描阴影。]

　　任何图像分析在具体运用中都有这些阴影存在，前二者可通过精密安装图像分析仪来控制，后者可通过对显像管的质量严格筛选来减少影响。阴影可贮存起来，并且在每上次扫描时同步地从图像信号中去掉。

图9-3　显微镜载物台移动方式1.载物台移动方向；

2.晕微镜观察视场；3.图像框；4.测量框

　　6．测量经以上各步骤后，可以用图像分析仪的计算机对图像进行测量来取得所需的参数，如灰度、面积、长度、个数等。原始的参数可由计算机转化成容易理解的数值，例如面积可由某图形所占像素数转化为平方微米，使观察者容易理解。

　　7．资料分析　将资料进行分类，并加以说明，以便做出结论。也可将资料贮存，随意可提取出来，供研究者使用。

　　8．其他事项

　　（1）标本要清洁：如果标本上有污点，研究者可分辨哪些是正常的免疫反应产物，哪些是污染引起的，但仪器不会区别，只要是电视屏幕上测量框内有的东西都会被测量，如测灰度时切片上有污点，会影响结果。

　　（2）电压要稳定：这一点是结合我国目前情况而言，虽然仪器使用时是通过稳压器的，也要经常注意稳压器上的电压指针是否稳定，否则也影响结果。

　　（3）价格问题：图像分析仪广泛应用于工业、农业、医学等领域，因此并不是价格愈贵就愈好，而要看我们的应用目的及其性能，以免购置一些用不着的昂贵的附件而造成浪费。一般可以从以下三方面来考察仪器性能：在本专业范围内应用的广度、运算的速度和操作的方便程度。

　　（4）合作使用：分析仪价格昂贵，根据国内目前实际情况，有些工厂购置了图像仪而仅仅用作工业金相分析，闲置的时间很多，我们从事医学研究的人可以去充分利用它的性能，联合进行科研工作，发四川省目前最高级的图像分析仪就是在工厂中而不是在高等学校中。

　　五、没有图像分析仪可否进行图像分析？

　　当没有图像分析仪时，研究者早已想到用网格来进行图像分析，也获得了客观的评定结果。网格可分为两大类：一类是置于目镜内的网格，可测量切片标本上的各种数据；另一类是大的网格，可放在照片上，光镜电镜照片均可用，对照片上的各种结构可进行测量。以上二者至今仍被采用。英国标线片公司提供许多型号的市售标线片（即网格）。有的国家制造的显微镜，将目镜与带有六种不同型号标线片的旋转盘装在一起，以便于观察者作各种测量。国内某些单位有自制标线片，并有少量出售。

　　Aalto等1982年曾在“免疫组织化学的形态测量法一卵巢肿瘤内的胚性癌抗原”一文中推荐用视野评分法，他用三种方法对PAP法免疫组化标本进行分析：①对全切片的染色进行分级。②在10×10放大倍数下，每一切片用目镜网格任选25个方形视场进行观察，并对每一视场进行分级。③在25个视场内取25个点的着色强度进行分级。染色强度分为0级、1级（轻度）2级、（中度）、3级（重度）。方法①的结果不同于②③，而方法②和③差别不大，说明主观估算的鉴别能力低，一般镜下观察不能确切反映染色强度。

　　用网格进行图像分析的方法很多，如用免疫荧光等方法显示神经纤维，要表示各处的纤维密度不同，除了文字描述如致密、稀疏等以外，用网格法就要客观一些，在目镜或照片上放上网格，观察阳性神经纤维与网格上的线条的交叉次数，排列密集的区域交叉次数必然多些，这就比较客观，重复性也较好。

　　用荧光显微镜观察免疫荧光标本，Ploem曾在1977年指出荧光强度之差至少要二倍才能在直观估计时显示出差别，说明人视觉对荧光强度变化不够敏感。作者在工作中体会到，可利用照相的自动曝光系统来作相对定量，因为荧光愈强则自动曝光时间愈短，荧光弱则自动曝光时间长，相当敏感，用眼睛观察二个荧光强度几乎无差别的细胞，也能在自动曝光时间上显示出差别来。作者曾经将许多荧光标本用相同的曝光时间拍在同一个胶卷中，冲洗后，荧光强的区域胶卷上显色深，荧光弱的区域胶卷上显色浅，因为荧光容易淬灭，用此法可将胶卷较长期保存，而且胶卷上的信息还可通过图像分析仪测灰度等数据。这些都是在实践中的一点经验，供读者参考。

　　用网格测量的具体操作举例：图9-4为一关联方测格，由于测点、测线、测面之间有互相关联的关系，故称为关联方测格。方格直线交叉称为测点，总数为100个，方格中所有直线称为测线，小方格边长为d如图中所示，测线总长度为200d,整个大方格为测面，测面总面积为100d²，测格周围的虚线不是测线。关联测格的优点是：只在计数位于欲测图像中的测点数P，就可计算位于该图像中的测线长度L及测面的面积A。计算方法为：L=2d·P，A=d²·P。

　　可将图9-4摄制于小的透明胶片上，剪成你所用的目镜筒的内径大小，将其置于目镜内，使测格清晰地叠映组织标本的图像上，则可进行测量。d的长度可用台微尺来确定。也可将9-4复印在较大的透明胶片上，可用来测量电镜照片或光镜照片，将透明胶片叠加在照片上即可进行测量。图9-5为一测量的例子：

图9－4　关联方测格

图9-5 示测点计数

　　此关联方测格共有测点100个（如果只计数粗测点则有25个），图像为一个肾小体的轮廓，包括血管球和肾小囊腔，测点计数的结果，在肾小囊腔内的测点数为12，在血管球内的测点为49个，整个肾小体内的测点为12+49=61个，用台微尺测出d的长度，则可得到此图像中肾小囊腔的面积，血管球的面积，肾小体的面积。明小囊腔与肾小体的面积比12：61=19.7%等多个参数。

　　值得提出的是，在显微镜下网格的线条有一定宽度，如图9-6所示。计数测点时如①箭头所示，即横线上缘与竖线右缘交点处为真正的测点，若此点落在图像外面则不能计数。如②箭头所示，此测线的上缘才能作为真正的测线。

图9-6 示真正的测点与测线

　　表面积密度的测定：免疫细胞化学电镜照片中的膜性结构如内质网、线粒体、细胞膜等都可测定表面积密度，光镜标本中的各种结构也可同样测定。表面积密度是指单位体积参照空间内特征物的表面积，通过数学运算可简便地用以下方法测定：测量单位面积参照面内特征物断面周界线的长度。如果某一个细胞的电镜照片作为参照面，线粒体作为特征物，欲测单位面积电镜照片内线粒体断面周界线的长度，可用以下公式：

　　S_V=2I_L

　　S_V表面积密度2I_L交点密度

　　I_L=测线与特征物断面周界线之间的交叉点数除以参照面内测线总长度。

　　图9-7为一咱摆线测格，可用来方便地测表面积密度。图中的平行直线不是测线，仅是为了便于计数交叉点和测点而画上的。图中的曲线即摆线，也就是测线，共45条，每条摆线长度d=1/10测格宽度(1cycloid arc =1/10×frame width) ，测格的宽度容易测量，如用目镜测格，可用台微尺测量，如用大的透明胶片，可实际用尺测量，因此每条摆线长度很易算出。测格中共有45条摆线，其总长为45d。图中直角短线（L）示测点，共90个，测线长度L与测点数P的关联关系为L=d/2·P。具体来说，用图9-7摆线测格，置于一个细胞的超微结构照片上，如果整个测格均位于照片内，则参照面内测线总长度为45d,如果90个测点只有60个落至细胞内（即测格中有30个测点落在此照片外）则参照面内的测线总长度为d/2·P=d/2×60=30d。摆线与特征物（如内质网膜、线粒体的膜等）的交叉点容易数，用上述I_L和S_V公式即可得出所需参数。此公式为经过数学上的研究而得出，我们可应用公式来作表面积密度的研究。

　　读者需注意的是：若特征物是各向同性分布，可采用任意方向的随机切片。若特征物呈各向异性分布，可采用垂直切片或其他一些方法制作的切片。Mattfeldt等曾提出在一个组织块中作三个互相垂直的切片（three mutually perpendiculer sections ）用作研究。目前通用的垂直切片的概念是1986年Baddeley等人提出，指垂直于某任意确定的水平面的随机切片，或平行于某一任意确定的垂直轴的随机切片。如图9-8所示，HP为水平面（horizontal plane），VP为垂直面（vertical planes），二个垂直面互相不是平行关系，成一定角度。在生物组织中，如皮肤的表皮、各种上皮的外表面均可作为水平面，只要与水平面垂直的各个方向所切的切片均为垂直切片。骨骼肌纤维的长轴、长骨的长轴均可作为垂直轴，与其平行的切片也作为垂直切片。管状的器官如消化管、呼吸管道等，可纵向剖开，展平，当作水平面，在其中作垂直切片如图9-9所示：以水平面为基准，垂直切片必需在随机的位置和随机的方向，在标本计划中，第一步是需要随机，常用一组系统随机位置的垂直切片（systematic randomly positioned vertical sections），第一个切面是随机的，其余切面则是与第一个切面或一定的角度而选择的，如图中（3）和（4）即表示三个不同的方向，但都垂直于同平面，即垂直切片互相间有一定的旋转角度。图9-7摆线测格中大箭头所示vertical 表示箭头方向与标本垂直轴一致，即图9-8中的verfical 所示方向。

　　如果有的标本没有可辨认的垂直轴，可任意确定一个水平面，来作垂直切片。

图9-7　示摆线测格