图18-5 DNA随机引物标记法
好，标记量大，杂交检出信号强。合成探针长度短，一般在20-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。合成探针设计还应注意碱基组成G≡C含40％-60％，一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。还要注意探针自身序列内应无互补区域以免产生“发夹”结构，影响杂交。一个好的探针最终在实践中才能加以确认。另外，还有利用M13噬菌体载体可复制单链DNA的特点，复制合成DNA探针，利用转录载体（DNA），转录合成RNA探针。下面就GIBCo BRL公司（Bethesda Research Laboratories美国）的缺口平移法标记生物素试剂盒（bionick labeling system）为例介绍如下：
| 试剂： | 10x dNTP Mix.250μl | 10x Enzyme Mix 250μl |
| 0.2mmol/L each dCTP，dCTP，dTTP | 0.5 units/μl DNA Polymerase Ⅰ | |
| 0.1mmol/L dATP | 0.0075 units/μl DNase Ⅰ | |
| 0.1mmol/L biotin-14-dATP | 50mmol/L Tris-HCl(pH7.5) | |
| 500mmol/L Tris-HCl(pH7.8) | 5mmol/L magnesium acetate | |
| 50mmol/L MgCl2 | 1mmol/L β-mercaptoethanol | |
| 100mmol/L β-mercaptoethanol | 0.1mmol/L phenylmethyl- | |
| sulfonyl fluoride | ||
| 100μg/ml nuclease-free BSA | 50％（v/v）glycerol | |
| 100μg/ml nuclease-free BSA | ||
| Control DNA：5μg pBR322 in TE | ||
| stop buffer 300 mM EDTA | ||
| autoclaved H2O |
操作步骤：
将5μl 10x dNTP Mix.；－μl DNA（相当1μg需标记的DNA量）；－μl灭菌蒸馏水加至45μl；再加5μl 10x Enzyme Mix.依次加入1.5-2ml离心管后。15000xg离心15秒钟。16℃保温1小时。加5μl Stop Buffer终止反应。乙醇沉淀，备用。