描述

本文介绍了一种改良的免疫荧光（IIF）协议，旨在维持绿色荧光蛋白（GFP）的荧光强度。

步骤

1. 将细胞培养至光密度（OD）为0.5。

2. 收集0.5-1毫升细胞，重悬于PBS中，加入4%的多聚甲醛（PFA）。如果使用常规的甲醛，直接向培养基中添加10%的体积。室温下孵育。对于HA免疫荧光，使用PFA固定时间不超过20分钟；对于纺锤体免疫荧光，较长的固定时间（1-2小时）效果更佳；对于GFP，固定时间为15-60分钟，并避免与甲醇接触。

3. 固定后，用1毫升0.1 M KPO4（pH 6.5）洗涤两次，再用0.1 M KPO4和1.2 M山梨醇（Phos/Sorb）洗涤两次（以10K转速离心1分钟）。重悬于1毫升Phos/Sorb中。此时细胞可在冰箱中保存过夜。如有需要，可进行超声处理。

4. 将0.5毫升细胞进行球状体化，剩余细胞储存于4℃（以备不时之需）。向0.5毫升细胞中加入1微升β-巯基乙醇和10微升氧化酶（1 mg/mL的储备液），在23℃下孵育约20-30分钟。

5. 在细胞球状体化的同时，准备涂有聚赖氨酸的载玻片：在每个孔中加入10微升聚赖氨酸溶液（0.1%在ddH2O中），在室温下孵育约1分钟。去除聚赖氨酸后，每个孔中加入约20微升ddH2O。去除ddH2O，重复洗涤并让其自然干燥。

6. 通过以3000转速离心3-5分钟收集球状体。用Phos/Sorb洗涤两次。对于Triton透化，进入第7步；对于甲醇-丙酮，进入第8步。

7. Triton：将细胞重悬于180微升Phos/Sorb中，加入20微升10% Triton。在室温下孵育1-2分钟，然后轻轻离心并用Phos/Sorb洗涤两次。重悬于200-500微升Phos/Sorb中，将10-20微升细胞放置在涂有聚赖氨酸的载玻片上。在室温下孵育20分钟，然后用PBS/BSA（1X PBS，1% BSA）洗涤两次。

8. 甲醇/丙酮：在每个涂有聚赖氨酸的孔中放置20微升细胞。让细胞沉淀10-20分钟。吸去上清液，立即（但轻柔地）浸入-20℃的甲醇中6分钟。转移至-20℃的丙酮中30秒。让载玻片自然干燥1-2分钟。每个孔中加入20微升PBS/BSA（1X PBS，1% BSA），将载玻片放入湿润箱中至少5分钟。

9. 在添加一抗之前吸去PBS/BSA。将一抗稀释在PBS-BSA中，每个孔中加入15微升。

10. 在室温下孵育1小时或在4℃下过夜。

11. 用PBS/BSA洗涤孔5次。加入二抗。如果二抗为抗山羊抗体，则在PBS中进行抗体反应。在黑暗中于室温下孵育2小时。

12. 用PBS/BSA洗涤孔5次。

13. 吸去最后一次洗涤液。在每个孔中加入一滴含DAPI的封片液，盖上盖玻片，避免气泡，并用指甲油密封。如果观察GFP，则不使用指甲油。将载玻片储存于-20℃。

抗体稀释：

一抗：小鼠抗微管蛋白（Sigma）1:500；小鼠抗HA（12CA5和16B12）1:250；兔抗Pds1（用于过表达样品）1:10,000。