背景介绍

Western blot（免疫印迹）是一种常用于检测和分析蛋白质表达的实验技术，广泛应用于分子生物学、细胞生物学及医学研究领域。该方法通过蛋白质电泳分离、转膜、免疫检测及信号显现等步骤，实现对目标蛋白的定量和定性分析。

实验步骤

1. 蛋白提取与电泳：从植物叶片中提取可溶性蛋白后，样品通过SDS-PAGE凝胶进行分离。SDS-PAGE操作参考Sambrook等人（1989）的标准方法。

2. 转膜：电泳后，将凝胶在转膜缓冲液（25mM Tris/192mM Glycine，15%甲醇，pH 8.2）中平衡20分钟。切割合适大小的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，先在100%甲醇中预湿5秒，再用蒸馏水洗涤5分钟，最后在转膜缓冲液中平衡15分钟。蛋白转移在BioRad Mini protein II转膜仪中进行，条件为4℃、60V、1小时。

3. 封闭与抗体孵育：转膜后，膜在Tris缓冲盐水（TBS，pH 7.6）中洗涤5分钟，然后在含5%脱脂奶粉和0.1% Tween20的TBS缓冲液中孵育1小时以封闭非特异性结合。随后，膜分别在同样的奶粉/TBS/Tween缓冲液中洗涤三次，每次10分钟，以及在含0.1% Tween20的TBS中洗涤一次10分钟。

4. 一抗孵育：膜在含5%脱脂奶粉的TTBS缓冲液中加入一抗，于室温下摇床上孵育过夜。之后用TTBS缓冲液洗涤四次，每次10分钟，去除未结合抗体。

5. 二抗孵育与检测：使用HRP标记的羊抗鼠二抗，在含5%脱脂奶粉的TTBS缓冲液中孵育2小时。之后用TTBS缓冲液洗涤四次，每次10分钟。加入2mL含Lumigen PS-3底物的检测试剂，室温孵育5分钟。多余检测试剂通过膜边缘接触纸巾去除。

6. 信号显现：膜用保鲜膜包裹后置于X光胶片盒中，在暗室红光条件下，将Hyperfilm ECL胶片覆盖于膜上。曝光后，胶片进行显影、冲洗和固定，获得蛋白条带信号。

参考文献

Sambrook et al., 1989；ECL Plus Western Blotting system技术手册（Amersham, UK）。