简介
S1核酸酶定位法是一种利用单链特异性核酸酶S1对DNA或RNA进行切割，从而确定核酸分子中特定单链区域位置的分子生物学技术。该方法常用于研究基因表达调控、RNA剪接位点及核酸结构分析。
实验步骤
1. 在无菌微量离心管中混合：
- 10 μl 末端标记的单链放射性标记寡核苷酸探针（稀释至每反应10,000至50,000 cpm）
- 20 μl 纯化的总RNA（或20 μg载体tRNA加体外转录RNA）
- 10 μl 3 M 醋酸钠
- 用双蒸水补足至100 μl反应体积
2. 加入0.3 ml 100%乙醇，-70°C孵育10分钟。
3. 以最高速在微量离心机中离心15分钟，弃上清液。
4. 向沉淀中加入1 ml 70%乙醇，颠倒混匀，-70°C孵育5分钟。
5. 再次以最高速离心15分钟，弃上清液。
6. 使用真空离心器将沉淀干燥。
7. 用10 μl 杂交缓冲液（详见提示2）溶解沉淀。
8. 加盖2滴矿物油，快速离心数秒分离相。
9. 在90°C加热变性DNA 5分钟。
10. 迅速转移至66°C水浴中，保持样品温度。
11. 在66°C下杂交3小时。
12. 配制S1消化混合液（每反应体积）：200 μl S1消化缓冲液，2单位S1核酸酶。
13. 将消化混合液等分至冰上的无菌微量离心管中。
14. 用移液器去除矿物油下的杂交液泡，转移至消化混合液管中（详见提示4）。
15. 充分涡旋混匀，快速离心数秒。
16. 37°C孵育30分钟进行消化。
17. 加入600 μl 100%乙醇，-20°C孵育1小时。
18. 最高速离心15分钟，弃上清液。
19. 小心用10 μl上样缓冲液溶解沉淀。
20. 90°C加热2分钟，迅速冰浴冷却。
21. 按DNA电泳标准程序进行电泳分析。
缓冲液配方
聚丙烯酰胺/尿素凝胶配方：200 μl 10%（w/v）过硫酸铵，10 ml 双蒸水，15 g 尿素，过滤脱气，3 ml 10X TBE，15 μl TEMED，6 ml 38%（w/v）丙烯酰胺:2%（w/v）双丙烯酰胺（注意安全）。
上样缓冲液：0.04%溴酚蓝，0.04%二甲苯氰酚FF，80%（v/v）脱离子甲酰胺（注意安全），1 mM EDTA，10 mM NaOH。
S1核酸酶缓冲液：1 mM 硫酸锌，0.25 M NaCl，50%（v/v）甘油，30 mM 醋酸钠，pH 4.6，-20°C保存。
S1消化缓冲液：5%（v/v）甘油，20 μg/ml 超声处理变性鲑鱼精子DNA，1 mM 硫酸锌，0.25 M NaCl，30 mM 醋酸钠，pH 4.6，过滤灭菌，-20°C保存。
杂交缓冲液（5X）：2 M NaCl，0.2 M PIPES，pH 6.4，5 mM EDTA，高压灭菌，-20°C保存。
实验用品
无菌微量离心管，移液器，水浴锅，微量离心机，真空离心器，电泳设备等。
注意事项与提示
1. 实验中使用的化学品具有生物危害性，操作时请参阅相关材料安全数据表（MSDS），佩戴适当防护装备。
2. 溶解DNA时，缓慢上下吹打溶液，置于37°C水浴中反复吹打加温，直至DNA完全溶解。
3. S1核酸酶单位定义为：37°C下30分钟内水解1微摩尔核苷酸的酶量。不同厂家单位可能不同，使用时需注意。
4. 转移矿物油下的杂交液时，无需担心矿物油进入消化混合液。
5. 电泳时电流控制在12至20 mA之间。