背景介绍

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种重要的条件致病真菌，也是真菌遗传学研究的模式生物。基因功能研究依赖于高效的基因敲除技术。本文介绍了一种基于大肠杆菌介导的λ红同源重组系统，快速构建烟曲霉基因缺失株的方法，显著提高了基因敲除的效率和便捷性。

方法流程

步骤一：将目标cosmid导入KS272(pKOBEG)大肠杆菌株
使用电转化或CaCl₂法将含有目标基因片段的cosmid转入携带pKOBEG质粒的KS272大肠杆菌。pKOBEG质粒编码λ红重组系统，诱导表达可促进同源重组。转化后在含氯霉素和目标cosmid抗生素的LB平板上30℃培养，筛选同时携带pKOBEG和目标cosmid的菌落，用于制备电转化感受态细胞。

步骤二：扩增双功能选择标记
以pCDA21质粒为模板，通过PCR扩增含有zeoR（抗zeocin）和pyrG（烟曲霉嘧啶合成基因）双功能标记的片段。引物设计包括50-60 bp的同源臂序列，分别对应cosmid上目标基因上下游区域，确保重组的特异性。PCR产物约2.7 kb，包含同源臂和选择标记。

步骤三：同源重组构建重组cosmid
将PCR产物经膜透析纯化后，电转化入KS272(pKOBEG + 目标cosmid)感受态细胞。通过λ红系统介导的同源重组，目标基因被双功能标记替换。转化后在含zeocin和相应抗生素的LB低盐平板（LBLS）上30℃培养，筛选重组子。随后在37℃培养以失活温敏质粒pKOBEG，获得纯合重组cosmid。

通过限制性酶切图谱、PCR和测序验证重组的准确性。设计特异性引物从双功能标记向外扩增，确认标记正确整合。

步骤四：烟曲霉转化及筛选
将重组cosmid（环状或经限制酶线性化并去磷酸化）转化入烟曲霉CEA17株（pyrG缺失株）。利用pyrG作为选择标记，筛选基因缺失株。线性化cosmid可提高双交叉重组率，减少单交叉事件。通过Southern杂交和药物敏感性测试进一步确认基因敲除。

关键技术点及注意事项

1. 电转化感受态细胞的制备质量直接影响重组效率，需严格控制培养条件和冷冻保存。
2. 调节阿拉伯糖浓度可优化λ红基因表达，提升重组效率。
3. PCR引物设计需确保同源臂位于目标基因外侧，避免非特异整合。
4. 不是所有cosmid均适用该系统，pWE15来源cosmid效果较好，LORIST2来源cosmid效果较差，原因尚不明确。

材料与试剂

1. 大肠杆菌KS272(pKOBEG)：携带温敏质粒pKOBEG，表达λ红重组系统。
2. 大肠杆菌BW19610(pCDA21)：含双功能选择标记模板质粒。
3. 烟曲霉CEA17株：pyrG缺失，用于基因敲除转化。
4. Zeocin抗生素及低盐LB培养基（LBLS），适合zeocin选择。
5. 相关抗生素（氯霉素、氨苄青霉素等）用于大肠杆菌筛选。

联系方式及资源获取

相关菌株和质粒可向法国巴斯德研究所微生物与环境单位的Christophe d'Enfert博士申请（邮箱：denfert@pasteur.fr）。Zeocin试剂可从Cayla公司（法国图卢兹）或Invitrogen公司（荷兰格罗宁根）购买。

总结

该方法利用λ红介导的同源重组技术，结合双功能选择标记，实现了烟曲霉基因缺失的快速构建。该策略简化了传统基因敲除步骤，提高了效率和准确性，为烟曲霉及相关真菌的遗传学研究提供了强有力的技术支持。