以下是根据美国国立卫生研究院老年病研究所提供的R1胚胎干细胞培养方案整理而成，并结合实际经验进行了部分修改。本指南详细介绍了小鼠胚胎干细胞（mESCs）的常规培养、冻存复苏、传代纯化以及体外分化方法，适用于R1细胞系，其他小鼠ES细胞系可参考调整。人类胚胎干细胞培养需使用专用方案和培养基。

一、一般培养：维持胚胎干细胞未分化状态

胚胎干细胞（ES细胞）培养需使用含有白血病抑制因子（LIF）和饲养层细胞的培养基（高糖DMEM），以抑制细胞分化。基质采用0.1%明胶包被的培养板。建议每2-3天对达到80%-90%融合的细胞按1:8比例传代。传代时，先将细胞接种于未包被的培养板中2小时，利用分化细胞贴壁的特性进行纯化，再将未分化细胞接种至明胶包被的培养皿。培养条件为37℃、5% CO₂、100%湿度。若使用饲养层细胞，需经丝裂霉素C（MMC）处理以抑制其增殖，但仍保持分泌LIF的能力。本文暂不涉及饲养层细胞，其可来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

培养基配制

ES培养基：配制20×不含DMEM、马血清（HS）和LIF的贮存液（也可用于EB培养基），分装后-20℃保存。使用时，取21ml贮存液、HS和LIF加入450ml DMEM中，0.22μm滤膜过滤，4℃保存不超过2周。

贮存液成分：DMEM（高糖）、马血清（HS）、L-谷氨酰胺（200mM）、MEM非必需氨基酸（NEAA，10mM）、HEPES（1M）、β-巯基乙醇（55mM）、青霉素/链霉素（PEST）、LIF。

细胞复苏

细胞冻存于含10%二甲基亚砜（DMSO）的冻存液中，DMSO可防止冰晶形成，但对细胞有毒性，需快速复苏。

步骤：
1. 从液氮中取出冻存管；
2. 37℃水浴中快速解冻（约2分钟），至仅剩少量冰晶；
3. 将细胞转移至15ml离心管；
4. 缓慢加入5ml ES培养基（冲洗冻存管）；
5. 300×g离心3分钟；
6. 弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，吹打至少10次；
7. 接种于明胶包被的6孔板或6cm培养皿；
8. 置于培养箱中培养。

细胞冻存

冻存液：90% HS + 10% DMSO。

步骤：
1. 用1×PBS洗涤细胞，留少许PBS；
2. 用细胞刮刀收集细胞；
3. 转移至15ml离心管，300×g离心3分钟；
4. 弃上清，用预冷的冻存液重悬（10cm皿用2ml，15cm皿用6-7ml）；
5. 分装至冻存管，每管1ml；
6. -80℃过夜，次日移入液氮。

明胶包被

配制0.1%明胶溶液：将0.5g明胶溶于500ml无钙镁PBS中（50-65℃水浴15-30分钟），趁热0.22μm滤膜过滤，4℃保存。

包被步骤：
1. 加入足量明胶溶液覆盖培养表面（15cm皿加2ml，10cm皿加0.5-1ml）；
2. 室温放置30分钟；
3. 吸去明胶溶液，培养板可室温保存（平放或倒扣）。

细胞传代与纯化

建议每2天传代，过度生长会降低分化率。通过差速贴壁去除分化细胞。

步骤：
1. 吸去培养液；
2. 无钙镁PBS洗涤；
3. 加入胰酶-EDTA，37℃孵育5分钟；
4. 加入ES培养基终止胰酶；
5. 300×g离心3分钟；
6. 弃上清，用2ml ES培养基重悬，吹打10-20次（ES细胞易聚集，需充分分散）；
7. 将细胞接种于未包被的培养皿中，培养2小时（分化细胞贴壁，ES细胞悬浮）；
8. 收集悬浮的ES细胞，转移至明胶包被的培养皿，吹打分散；
9. 按1:4-1:10比例传代（推荐1:8，以降低自然分化率）。

二、体外分化

胚胎干细胞可分化成多种细胞类型。以下方法有利于神经前体细胞的分化：通过最少培养基选择（第3步）、bFGF扩增（第4步）和最终分化（第5步）。全程培养于37℃、5% CO₂、100%湿度。也可用低浓度视黄酸（RA）诱导神经分化。

时间线：总时长27-34天。第2步：4+1天；第3步：4-10天；第4步：4天；第5步：10-15天。

体外向心肌细胞分化

去除LIF后，ES细胞可自然向心肌细胞分化。小鼠R1系通常在7-8天出现搏动的心肌细胞，与胚胎发育时间线一致。

培养基配制

EB培养基：配制20×不含DMEM、胎牛血清（FBS）和LIF的贮存液（同ES培养基）。使用时，取21ml贮存液和50ml FBS加入450ml DMEM中，0.2μm滤膜过滤，4℃保存。

ITSFn和N3分化培养基：配制20×不含DMEM/F12的贮存液，分装后-20℃保存。使用时加入DMEM/F12，4℃保存。N3培养基中bFGF终浓度为10ng/ml（第4步加入）。

贮存液成分：DMEM（高糖）、转铁蛋白（50mg/ml）、胰岛素（5mg/ml）、亚硒酸钠（300μM）、黄体酮（20μM）、腐胺（100μM）、PEST、层粘连蛋白（100μg/ml）、纤维连接蛋白（250μg/ml）、碱性rhFGF（10μg/ml）。

包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白培养板

包被液：多聚-L-赖氨酸（15μg/ml，溶于PBS）和纤维连接蛋白（1μg/ml，溶于PBS）。

步骤：
1. 加入多聚-L-赖氨酸，室温至少2-3小时（可过夜）；
2. 吸去，加入纤维连接蛋白，室温1-2小时；
3. 吸去，晾干30分钟；
4. 4℃保存。24孔板每孔200μl，6孔板每孔500μl。

体外分化步骤

第1步：ES培养基培养，维持未分化状态。

第2步：EB培养基中形成胚状体（4天）。
1. 纯化细胞（见传代部分）；
2. 纯化2小时后，计数细胞，离心；
3. 用2ml EB培养基重悬，吹打制成单细胞悬液；
4. 接种于15cm细菌培养皿（4-5×10⁶细胞/皿）；
5. 2天后换液：将胚状体转移至锥形管，静置3-5分钟沉降，弃上清，重悬于新鲜EB培养基，接种至新细菌培养皿；
6. 第4天，将胚状体转移至未包被的组织培养皿（1个细菌培养皿对应1个组织培养皿），再培养1天使胚状体贴壁。

第3步：ITSFn培养基中选择神经前体细胞（约10天）。
1. 胚状体贴壁1天后，换为ITSFn培养基；
2. 小心换液，避免丢失未贴壁胚状体；
3. 每2天换液，神经样细胞通常在4-7天出现。当清晰可见时（约第6-10天），转入第4步。

第4步：N3培养基+bFGF扩增神经前体细胞（4天）。
1. PBS洗涤，加入胰酶，37℃孵育5分钟；
2. 加入EB培养基终止，转移至锥形管静置3-5分钟，取上清离心；
3. 用含bFGF的N3培养基重悬；
4. 接种于包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（24孔板每孔3.5×10⁵细胞，6孔板每孔1.7×10⁶细胞）；
5. 2天后换液。

第5步：N3培养基中分化（10-15天）。
1. 接种4天后，换为不含bFGF的N3培养基；
2. 每2天换液；
3. 分化10-15天后固定细胞：吸去培养基，PBS洗涤，4%福尔马林室温固定30分钟，PBS洗涤2次，保存于PBS（长期保存加0.01%叠氮钠）。

移植细胞准备

胚状体形成4天后（第2步末）移植。将胚状体转移至15ml锥形管，静置3-5分钟沉降（或离心），弃上清，用无钙镁PBS重悬，离心，加入1×胰酶（10cm皿加1ml），37℃水浴5分钟，加入5ml EB培养基轻轻吹打10次，离心，重悬于500μl EB培养基，用光滑巴斯德吸管吹打5次，离心，重悬于100μl EB培养基。

烟酸己可碱标记ES细胞
1. 配制10μg/ml烟酸己可碱染液（双苯酰亚胺）：取1mg溶于5ml EB培养基（200μg/ml），再稀释至10μg/ml；
2. 将细胞重悬于2ml染液，室温或冰上孵育30分钟；
3. 离心，弃上清，用2ml EB培养基重悬洗涤，重复一次；
4. 离心，重悬于100μl EB培养基，置于冰上。