一、引言
电子显微镜（Electron Microscopy, EM）样品制备是获得高质量超微结构图像的关键步骤。固定剂和包埋介质的配方直接影响样品的保存质量、切片性能和成像效果。本文介绍Kristen M. Harris实验室在连续切片中使用的标准固定剂与包埋配方，以及可调节体积的灵活制备方法。
二、固定剂配方
2.1 标准戊二醛固定液
戊二醛是最常用的电镜固定剂，能够通过交联蛋白质有效保存细胞超微结构。
配方（0.1M 磷酸盐缓冲液，pH 7.4）：
| 成分 | 浓度 | 体积 | 备注 |
|---|---|---|---|
| 25% 戊二醛 | 2.5% | 10 mL | 终浓度2.5% |
| 0.2M 磷酸盐缓冲液 | — | 50 mL | — |
| 蒸馏水 | — | 加至100 mL | — |
制备步骤：
-
取10 mL 25%戊二醛水溶液
-
加入50 mL 0.2M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）
-
用蒸馏水定容至100 mL
-
混匀，4℃避光保存
注意事项：戊二醛在碱性条件下易聚合，应保持pH 7.2-7.4；长期存放建议分装冷冻保存。
2.2 多聚甲醛-戊二醛混合固定液
对于需要更好膜结构保存的样品，推荐使用多聚甲醛与戊二醛的混合固定液。
| 成分 | 终浓度 | 体积（100 mL） |
|---|---|---|
| 16% 多聚甲醛 | 2% | 12.5 mL |
| 25% 戊二醛 | 2% | 8 mL |
| 0.2M 磷酸盐缓冲液 | 0.1M | 50 mL |
| 蒸馏水 | — | 加至100 mL |
制备步骤：
-
加热0.1M磷酸盐缓冲液至60℃
-
缓慢加入多聚甲醛粉末，搅拌溶解
-
冷却后加入戊二醛
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调整pH至7.4
-
过滤除菌，4℃保存
三、包埋介质配方
3.1 Epon 812 包埋配方
Epon 812是最常用的透射电镜包埋介质，具有切片性能好、电子束下稳定性高的优点。
基础配方：
| 成分 | 体积（mL） | 重量（g） |
|---|---|---|
| Epon 812树脂 | 20.0 | 21.6 |
| DDSA（十二烯基丁二酸酐） | 12.0 | 12.9 |
| NMA（纳迪克甲基酸酐） | 8.0 | 8.6 |
| DMP-30（促进剂） | 0.6 | 0.66 |
说明：黄色高亮部分可根据需要调整体积，重量将自动重新计算。
制备步骤：
-
按顺序将Epon 812、DDSA、NMA加入烧杯
-
在60℃烘箱中预热15分钟，使成分混合均匀
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冷却至室温后加入DMP-30
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用玻璃棒充分搅拌5-10分钟
-
真空脱气15分钟除去气泡
3.2 Spurr包埋配方
Spurr树脂粘度低，渗透性好，适合用于需要快速渗透的样品。
| 成分 | 重量（g） | 体积（mL） |
|---|---|---|
| VCD（乙烯基环己烯二环氧化物） | 10.0 | 11.5 |
| DER 736（环氧树脂稀释剂） | 6.0 | 6.8 |
| NSA（壬烯基丁二酸酐） | 26.0 | 27.5 |
| DMAE（二甲基氨基乙醇） | 0.4 | 0.45 |
制备步骤：
-
按顺序称量VCD、DER 736和NSA
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充分搅拌混合
-
加入DMAE作为催化剂
-
继续搅拌至均匀
-
真空脱气后使用
3.3 硬化条件
| 树脂类型 | 温度 | 时间 | 备注 |
|---|---|---|---|
| Epon 812 | 37℃ | 12小时 | 初聚合 |
| Epon 812 | 45℃ | 12小时 | 继续聚合 |
| Epon 812 | 60℃ | 48小时 | 完全聚合 |
| Spurr | 70℃ | 8-12小时 | 一步聚合 |
四、连续切片专用配方调整
对于连续切片（Serial Sectioning）应用，需要特别考虑以下因素：
4.1 硬度调整
连续切片要求包埋块具有一定的硬度和韧性，以获得连续、平整的切片带。
| 硬度要求 | Epon比例 | DDSA/NMA比例 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| 较软 | 1:1.5 | 高DDSA | 大型组织 |
| 中等 | 1:1 | 1:1 | 常规样品 |
| 较硬 | 1.5:1 | 高NMA | 小型样品/单细胞 |
4.2 渗透优化
对于不易渗透的致密组织，建议采用梯度渗透方案：
-
30%树脂/70%脱水剂：室温过夜
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50%树脂/50%脱水剂：4-6小时
-
70%树脂/30%脱水剂：4-6小时
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100%树脂：过夜（更换2-3次）
-
新鲜树脂包埋：聚合
五、质量控制与常见问题
5.1 包埋质量检查指标
| 检查项目 | 标准 |
|---|---|
| 树脂颜色 | 浅黄色至琥珀色 |
| 气泡 | 无可见气泡 |
| 聚合后硬度 | 指甲划痕浅而清晰 |
| 切片性能 | 连续切片无震颤 |
5.2 常见问题与解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 树脂不聚合 | DMP-30不足或失效 | 增加促进剂比例 |
| 聚合后发软 | 交联剂比例不当 | 调整DDSA/NMA比例 |
| 切片震颤 | 包埋块过硬 | 降低树脂比例 |
| 组织收缩 | 脱水不彻底 | 延长脱水时间 |
| 气泡 | 混合不均匀 | 延长搅拌和脱气时间 |
六、试剂储存与安全注意事项
6.1 储存条件
| 试剂 | 储存温度 | 有效期 |
|---|---|---|
| Epon 812 | 室温，避光 | 2年 |
| DDSA | 4℃，密封 | 1年 |
| NMA | 4℃，密封 | 1年 |
| DMP-30 | 4℃，干燥 | 1年 |
| 戊二醛 | 4℃，避光 | 6个月 |
6.2 安全注意事项
警示：环氧树脂及其相关化学试剂具有刺激性、致敏性和潜在致癌性。操作时务必遵守以下安全规范：
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在通风橱内操作
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佩戴丁腈手套（乳胶手套防护效果不佳）
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穿戴实验服和护目镜
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避免皮肤直接接触，若不慎接触立即用大量清水冲洗
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废弃物按有害化学品规定处理
七、配方调整计算表
根据您的实验需求，可使用下表调整配方体积（黄色区域可编辑）：
| 成分 | 体积比例 | 体积（mL） | 重量（g） |
|---|---|---|---|
| Epon 812 | 1.00 | — | — |
| DDSA | 0.60 | — | — |
| NMA | 0.40 | — | — |
| DMP-30 | 0.03 | — | — |
使用说明：在体积列输入所需体积，重量将自动计算（密度：Epon 812约1.08 g/mL，DDSA约1.08 g/mL，NMA约1.08 g/mL，DMP-30约1.10 g/mL）。
参考文献
[1] Harris KM, Stevens JK. Dendritic spines of CA1 pyramidal cells in the rat hippocampus: serial electron microscopy with reference to their biophysical characteristics. J Neurosci. 1989;9(8):2982-2997.
[2] Luft JH. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol. 1961;9(2):409-414.
[3] Spurr AR. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. J Ultrastruct Res. 1969;26(1):31-43.
[4] Hayat MA. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications. 4th ed. Cambridge University Press; 2000.