荧光原位杂交法:分子杂交作图法和荧光原位杂交(FISH)

2009年06月25日

　　分子杂交作图法和荧光原位杂交（FISH）片段间重叠的信息来自于每一个片段所含内部实质意义的部分信息。在解释什么是部分信息以前，必须强调的是，在这里我们称片段为克隆(clone)。在用差别的方式将每份目标DNA分子打碎并将片段克隆之后，我们就得到了几千个克隆构成的调集，称做克隆库(clone library)。

　　每一个克隆的部分信息是通过杂交实验（hybridization experiment）来获得的。在这些实验里，我们检测被称为探针(probe)的小序列可否与克隆结合或杂交，如果发生了结合，就说明该克隆包含与该探针序列互补的序列。对于同一个克隆，我们对采用差别的探针重庞大交实验，与该克隆杂交的所有探针的调集称为该克降的指纹。指纹重叠的两个克隆可能来自目标叫A分子的交叠区域。例如，如果我们知道了探针人x、y、z可能与克隆A结合，而探针x、w、和z能与克降B结合，我们就很在理由相信克隆A和B互相交叠，如图2所示(除非存在重复片段)。注意，这类信息一般其实不能足以使我们确定这些探针在目标DNA中的位置，而仅能确定它们的相对顺序。

　　在杂交实验中各种纰缪都可能发生。首先，探针可能结合失败，这就产生了假阴性(False negative)的结果；其次，探针也可能结合到了不该结合的位置上，产生假阳性(false positive)结果；有时候还会出现人为对实验结果的判读纰缪，这也可能产生假阳性或假阴性结果。有时候，甚至在杂交尚未发生前纰缪就已出现。在克隆过程中，DNA分第二代杂交捕捉法子的两个片段可能会发生融合并像纯一克隆那样进行复制，这种克隆称之为嵌合克隆(chimeric clone)．它可使人们产生关于探针相对顺序的纰缪推断；嵌合现象常有发生，故其已成为杂交作图中的一个严重问题。有预计以为在许多克隆库中有高达40％一60％的克隆实际上是嵌合体。克隆过程中的另一类纰缪是缺失(deletion)，即克隆丢失了一个内部片段，因而使目标DNA分子中两个本不相邻的片段连接在一路.

　　另外还有两种环境也可使杂交标图过程出现问题。第一是探针不唯一，这意味着探针可与目标DNA分子一个以上的位点结合，这些位点序列称为重复序列(repeat)。一种称做序列标记位点(sequence tagged site, sts)的技术可避免这个问题，它产生的探针可与目标DNA分子上专一的位点进行杂交。第二个问题是数据缺乏，因为在杂交实验中完成所有的杂交不太可行。分享技术(pooling technique)是解决此类问题的措施。

　　荧光原位杂交—FISH

　　1.原理

　　荧光原位杂交(FISH)就是用标记有荧光分子的—小段DNA序列(探针)，在合适的湿度和盐离子浓度条件下，与染色体上的互补序列特异地退火结合而不破坏染色体的整体形态，以便在显微镜下观察到此特异的DNA序列及其在染色体上的位置。

　　2. 概说

　　以往均使用同位素标记探针用于原位杂交。这种方法敏感性非常高，曾在物理作图中起到很大的作用。但其纰缪谬误也是很较着的，首先是放射性废液对环境和操作者的危害；其southern印迹杂交法次，放射自显影需要—个曝光显影的过程，往往将要数周至数月，实验周期很长；第三，杂交违景深，需要在观察大量标本的基础上，颠末较为繁琐的步伐才能得出结果，影响了定位的精确度；此外，放射性同性素标记的探针不易生存，必须现用现做。1977年，Bauman和Langer首次分别应用荧光素和生物素标记核苷酸探针进行原位杂交获得成功。近年来，由于方法学的不停进步，FISH检测的灵敏度提高了4个数量级，从以前的只能检测到高度重复的序列，如小鼠的卫星DNA(约10Mbp)，到现在可以在单个细胞中检测到小到lkb的单拷贝基因。从方法上来说，F15H已经完全取代了用同性素标记进行的染色体原位杂交。 FISH的检测敏感性与同位素原位杂交八两半斤，其空间分辨率和基因定位的准确性却大大提高。

　　3. 荧光原位杂交技术的基本操作步调

　　(一)染色体或间期核玻片标本制备

　　(1)将用96％乙醇浸泡过的载玻片擦干或晾干；

　　(2)往玻片上哈一口气；

　　(3)用滴管在玻片的正中滴一滴细胞悬浮液，室温自然干燥。一般以室温老化4-7天后，用于FISH杂交为佳

　　（二)探针制备和标记

　　1．探针的来历用作FISH探针的DNA可以来自质粒、噬菌体、粘粒、P1载体、PAC、BAC或YAC等多种载体，原则上大于1kb即可，但最好大于10kb，以便于杂交和在荧光显微镜下辨认。DNA的质量直接影响探针标记的效率，但按常规方法拍摄的DNA，其质量巳足以用于探针标记，不需进行特殊处理。

　　2．探针标记方法豁口平移第二代杂交捕捉法法(nick translation)和随机引物法(random primer)均可。而且可购买到现成的试药盒。按标记物差别又可分为直接标记法和间接标记法，用生物素(biotin)或地高辛配体(digoxingenin)标记称为间接标记，杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号，因而步调较多、操作贫苦，其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大，需进行染色休定位的基因片段往往较小，因而间接标记具有其上风；直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记；由于直接标记的揉针杂交后可马上观察到荧光信号．省去了繁琐的免疫荧光反应，再也不需要购买荧光抗体，也由于近年来荧光素的亮度和抗淬灭性的不停改进和提高，直接标记的荧光探针越来越成为首选，其荧光强度和信号大小都易于在平凡荧光显微镜下观察。操作过程中也不需要严酷避光，使FISH过程变得简便而易于操作。纰缪谬误是信号不能放大。

　　(三)试药准备F1SH前一日

　　1．去高子甲酰胺甲酞胺300ml中加去离子树胶30g，剧烈拌和至少4h，用滤纸过滤后于4℃生存；

　　2．20×SSC 氯化钠175g，柠檬酸三钠88.2g，加三蒸水至l 000ml；

　　3．蛋白酶K(PK)应用液(1mg／m1) PK(20mg／ml)50ul加三蒸水至1000ml

　　4．PK(蛋白酶K)缓冲液 1M Tris HCl(pH 7.4)20m1，1M LaCl2 2m1加1000m1；

　　5．RNase(0.lug／ul) RNase储存液(10mg／m1)20u1加2×SSC(PH 7.0)2ml。

　　（四）玻片标本的变性

　　(1) 70％甲酰胺／2×SSC〔预热至70℃，将玻片放入变性2min。

　　(2) 掏出玻片，70％，80％，90％，100％乙醇脱水各2min，干燥。

　　(五)探针的变性

　　(1)75℃水浴变性7min；

　　(2)掏出，立即置冰中3min；

　　(3) 37℃预杂交1—2h。

　　(六)原位分子杂交

　　将探针加在玻片标本上，封片37℃温箱杂交过夜

　　（七)洗片

　　于水浴中准备下列试药(PH均需在使用前调至三系法杂交稻子7.0)并预热至45℃，按顺序洗片，每缸3min：3缸50％甲酰胺／2×SSC，3缸2×SSC，2缸0.1×SSC，1缸4×S SSC/0.1%Tween

　　(八)免疫荧光显色

　　(1)每片加50ul荧光抗体，37℃孵育30min

　　(2)4×SSC／0.1％Tween洗3次，每次2min。

　　(九)染色

　　每片加20ul DAPI染色。

　　(十)荧光显微镜观察及图像摄取很抱歉，因为您在网易相册发布了违规信息，账号被屏蔽。被屏蔽期间他人无法访问您的相册。

　　去帮助中间，相识如何重新恢复办事。 (责任编辑：glia)

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