NA的组织及细胞固定，也可用于新鲜冰片切片后固定。

　　②10%福尔马林试剂：

　　较适于固定细胞。

　　③10%中性福尔马林

　　市售甲醛　　　　　　　　　　　100ml

　　Na2HPO4　　　　　　　　　　　　　　　　4g

　　NaH2PO4　　　　　　　　　　　　　　　6.5g

　　DEPC水　　　　　　　　　　　～1000ml

　　常用于石蜡样品切片的固定。

　　10%的甲醛由于有促进DNA双链分子交联的作用，干扰DNA变性，故不适于DNA杂交。在组织或细胞原位杂交中，可通过使用含50%甲酰胺的杂交液使DNA变性解链而解决。这类固定液在DNA/RNA杂交中有较好的效果。

　　3．4%戊二醛效果较40%差。

　　4．0.1%戊二醛常用于固定组织，适于新鲜组织冰冻切片及石蜡切片的后固定，常用于检测DNA的原位组织杂交方法。

　　5．乙醇/醋酸（或冰醋酸）将乙醇与醋酸按3：1的体积比充分混合即可。该液较适于固定细胞的原位杂交，尤其检测DNA时。

　　乙醇/醋酸虽广泛应用于原位杂交中，但RNA保留较差，可本底很低，即背景染色淡。

　　6．甲醇/醋酸（3：1）用前按体积比3：1比例充分混合即可。

　　7．甲醇/丙酮（1：1）适于培养细胞的原位杂交技术。

　　8．4%多聚甲醇-0.5%～1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸缓冲液中，用于免疫电镜样品固定。

　　四、LB培养基

　　（一）液体LB培养基（Luria-Bertani培养基）

　　配制：取一1000ml的烧杯，将事先称取好的试剂加入杯内，加H2O约500～800ml搅拌使其溶解完全。用5N的NaOH调pH至7.0,加入H2O定容至1000ml。15磅高压灭20min。

　　（二）琼脂糖平板培养基　

　　细菌培养用琼脂（或琼脂糖）　　　　15g

　　液体培养基（如LB）　　　　　　　　～1000ml

　　按浓度比例，将琼脂加入液体培养基（如LB）中，稍加搅拌，用纱布或纸封好瓶口，15磅高压灭菌20min。

　　五、小量质粒提取主要液体

　　1．溶液Ⅰ

　　2．溶液Ⅱ

　　3．溶液Ⅲ（3mol/L醋酸钠）

　　加热溶解后，再用冰醋酸（约40ml）调pH至4.8，补足H2O至200ml。

　　六、杂交前处理

　　1．蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：

　　精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20℃存放，用时再取出冻融，余者弃去。

　　（2）工作液（临用前配）：

　　取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。

　　（3）关于P-K缓冲液的配制：

　　称取上述试剂，充分混合即可。

　　②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：

　　先将Tris于800ml ddH2O中溶解，用HCl将pH调至8.0,ddH2O定溶于1000ml，高压灭菌，室温备用即可。

　　③0.5mol/L的EDTA：

　　称取EDTA溶于约600ml ddH2O中，常需60℃持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。

　　2．甘氨酸

　　（1）1mol/L甘氨酸：

　　称取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中，最后补足ddH2O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。

　　（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：

　　将二者按1：10比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。

　　甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用，以防过度消化。

　　3．0.25%醋酸-0.25%醋酸酐

　　配制：按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及浓HCl。DEPC水定容至约1000ml(997.5ml)，临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓HCl 溅出，最好在通风条件下进行。

　　生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。

　　4．RNA酶溶液

　　取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份（1ml,10mg/ml），-20℃储存。

　　临用前，取RNA酶A储备液，用2×SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）.

　　5.0.2%

　　取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。

　　七、杂交用液

　　1．SSC（Standard Saline Citrate, SSC）

　　通常配成10×，20×，50×的储备液，如下：

　　配制：先称取上述两种试剂，溶于约800ml ddH2O中，滴加10N的NaOH，将pH值调至7.0，补足ddH2O至1000ml，加入终浓度为0.1%～0.2%的DEPC，分装后高压灭菌，可室温保存。

　　该液主要用于配制予杂交液及杂交后的各种洗脱液，以保持一定的离子强度。此外，在用于杂交的湿盒内也常用5×的SSC以保持一定湿度。

　　2．Denhardt’s液

　　通常配成10×，50×或100×的储备液

　　配制：称取上述试剂，溶于800ml左右灭菌ddH2O中，定容至1000ml后，过滤后于-20℃保存备用。

　　该液用于配制杂交液及予杂交液等。

　　3．杂交液及予杂交液

　　※：临用前加；△予杂交液不加

　　配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50℃促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装（最好用铝箔将瓶子包好）存于4℃，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染。

　　变性被打断的无关DNA（常为鲑精DNA或鲱精DNA）可在予杂交及杂交前加入。此外，有许多物质如肝素、多聚腺甘酸、醋酸钠等多种成份，可根据需要加入杂交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。

　　配制好的杂交液不宜反复冻融，否则易产生硫酸葡聚糖沉淀现象。使用前最好加热至50℃，使其充分溶解后再加入探针分子。至于探针的浓度视实验目的、探针类型及标记方法而异。通常RNA探针分子浓度为0.5～2μg/ml，DNA探针浓度为1μg/ml,此外，如使用35S标记的探针，还需加入终浓度为100mmol/L的二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）至杂交液及杂交后的洗脱液中。

　　八、杂交后漂洗溶液

　　无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。在此，归纳几种带有共同性及常用的洗脱液。

　　该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度（张力）较高。

　　该液常用于杂交后的第二次洗脱，离子强度较低，经过上述两套洗脱液洗后，有的还可用2×SSC，10%（0.1%）SDS洗脱。

　　主要是洗去残留的RNA，降低背景。用于以RNA为探针的原位杂交方法中。

　　4．Dig标记探针杂交后处理液

　　用ddH2O溶液并定容至1000ml。

　　用ddH2O溶解并定容至1000ml。

　　配制同上。

　　左旋咪唑有消除内源性磷酸酶的作用。

　　九、原位杂交信号显示

　　目前应用原位杂交方法中，信号的显示主要有放射自显影，酶底物及免疫金银等方法，在此归纳有关的主要试剂。

　　1．A-B显影液

　　称取上述试剂，按配方分别溶于50ml ddH2O中，于显影前，在室温将两者（A液及B液）按1：1混合，稍加摇动促进混合，即可将贴有切片标本的切片放入显影液，于室温避光（可暗室）反应5～15min。显影时间和温度相关，需自己根据情况摸索。终止反应只需将显影液倒出，自来水冲洗即可。倒出的AB显影液可暂时不扔，光镜下观察，若明显显影不够，还可重新或继续显影。AB显影液要求临用前配制，在显影时才将AB二液混合。否则，A液过久会产生黄色沉淀，增加背景。

　　AB液用于免疫金银法中，使金标记颗粒信号放大，形成棕黑色沉淀。

　　2．DAB-H2O显色液

　　配制方法见附录一。

　　该液用于标本被标记上辣根过氧化物酶（HRP）的方法。产物为棕黄色。

　　3．NBT-BCIP显色液

　　配制方法，详见附录一。

　　该液用于有碱性磷酸酶标记物的方法中。产物为紫蓝色。

　　4．Kodak D-19显影液

　　配制：先将500ml水中加温50℃，按上述配方顺序加药，同时充分搅拌，每加一种药完全溶解后，再加另一种药品，否则，所配的显影液易产生混浊而效果差，最后补足水至1000ml充分混合，室温或4℃避光保存。最好包上纸。

　　该液用于放射自显影时的显影。

　　5．Kodak F-5定影液（酸性坚膜定影液）

　　※：28%醋酸为3份冰醋酸和8份水混合液。

　　配制：同Kodak D-19显影液。 (责任编辑：glia)