作者：刘飞　赵云凤　李明哲　 文章来源：临床口腔医学杂志　

　　2.3 适宜的探针和较佳的标记方法。本实验采用39个碱基的寡核苷酸探针，长度短，易进入细胞，杂交率高；本实验采用加尾标记法，通过末端转移酶将数个地高辛标记的dUTP加在探针3’末端，使信号更易被检测。
　　2.4 合适的抗地高辛碱性磷酸酶孵育时间及显色时间。为了增强敏感性，本实验中抗地高辛抗体的孵育时间较长，为3h，显色时间也较长，为14h。同免疫组化法类似，适当延长抗体孵育时间及显色时间有助于增强信号。但显色时间过长会造成背景加深，使结果的特异性减弱，本实验在摸索阶段时对显色时间与信号强度的关系进行了反复实验，最后采用了14h，因为此时不但信号很强，而且切片的背景较佳。
　　3.　杂交特异性控制
　　为了增强杂交的特异性，本实验采取了如下措施：
　　3.1 杂交前用乙酸酐和稀酸处理。经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断，这样就可以防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，减少非特异性染色，本实验也用0.2M HCL处理切片，稀酸能使碱性蛋白变性，结合PK消化，易将之移除，这样也可避免碱性蛋白与探针之间的非特异性结合。
　　3.2 预杂交可阻断载玻片和组织标本中可能与探针产生非特异性结合的位点。
　　3.3 高严格度条件下进行杂交后洗涤。为了保证能将合不相配碱其对的杂交体充分洗去，减低背景，增加信/噪比，本实验杂交后在恒温振荡器内进行了从高浓度到低浓度，从低温到高温的充分洗涤。
　　3.4 采用特异性序列的寡核苷酸探针。该探针与编码大鼠Ⅰ型胶原α1（Ⅰ）链N-前肽的特异性区域mRAN互补。该序列与基因库中其它核苷酸序列无明显相同之处。
　　3.5 为了检测本实验的特异性，还设置了一系列的阴性实验，均得到了阴性结果。

作者单位：刘飞（610041，华西医科大学口腔医学院）
赵云凤（610041，华西医科大学口腔医学院）
李明哲（610041，华西医科大学口腔医学院）

参　考　文　献

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