本文旨在建立并优化大鼠牙周膜I型胶原mRNA的原位杂交方法，为牙周组织再生研究提供技术基础。原位杂交技术能够定位特定mRNA在组织中的表达，对于研究牙周膜中胶原蛋白的合成与调控具有重要意义。
2.3 适宜的探针和较佳的标记方法。本实验采用39个碱基的寡核苷酸探针，长度短，易进入细胞，杂交率高；采用加尾标记法，通过末端转移酶将数个地高辛标记的dUTP加在探针3'末端，使信号更易被检测。
2.4 合适的抗地高辛碱性磷酸酶孵育时间及显色时间。为了增强敏感性，本实验中抗地高辛抗体的孵育时间较长，为3小时，显色时间也较长，为14小时。同免疫组化法类似，适当延长抗体孵育时间及显色时间有助于增强信号。但显色时间过长会造成背景加深，使结果的特异性减弱。本实验在摸索阶段对显色时间与信号强度的关系进行了反复实验，最后采用14小时，因为此时信号很强且切片背景较佳。
3. 杂交特异性控制。为了增强杂交的特异性，本实验采取了如下措施：
3.1 杂交前用乙酸酐和稀酸处理。经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断，防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，减少非特异性染色。本实验也用0.2M HCl处理切片，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶K消化，易将之移除，避免碱性蛋白与探针之间的非特异性结合。
3.2 预杂交可阻断载玻片和组织标本中可能与探针产生非特异性结合的位点。
3.3 高严格度条件下进行杂交后洗涤。为了保证将不相配碱基对的杂交体充分洗去，减低背景，增加信噪比，本实验杂交后在恒温振荡器内进行了从高浓度到低浓度、从低温到高温的充分洗涤。
3.4 采用特异性序列的寡核苷酸探针。该探针与编码大鼠I型胶原α1(I)链N-前肽的特异性区域mRNA互补，该序列与基因库中其他核苷酸序列无明显相同之处。
3.5 阴性对照实验。为了检测本实验的特异性，设置了一系列阴性实验，均得到阴性结果。
作者单位：刘飞（610041，华西医科大学口腔医学院）；赵云凤（610041，华西医科大学口腔医学院）；李明哲（610041，华西医科大学口腔医学院）
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